钙火花在重症失血性休克血管反应性中的作用

摘要】目的 研究钙火花在重症失血性休克血管反应性中的作用。方法 应用激光共聚焦显微镜成像技术和细胞内记录正常和失血性休克2小时后大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌细胞（arterial smooth muscle cell，ASMC）的钙火花和膜电位的变化。结果 休克组的钙火花荧光值比正常组的显著增高并且膜电位显著降低。结论 失血性休克2小时，钙火花和BKCa活动增强与ASMC细胞膜超极化密切相关。 【关键词】失血性休克 钙火花

休克是一个复杂的病理过程，晚期休克难治的重要原因之一是微血管丧失对升压药物的反应性。Cryer等也报道脓毒性休克时骨骼肌的微动脉舒张，正是这种小血管的舒张导致外周血管阻力下降，对缩血管物质的反应性减弱或消失，以致血压不能维持[1]。这种微循环的衰竭几乎在各型休克的末期都会发生，也是休克病人死亡率居高不下的重要原因之一，但其发生的确切机制尚未完全查明。 大电导钙激活钾通道BKCa在平滑肌上分布密度大（1-4个通道/μm2），作用广泛，在血管等平滑肌细胞，BKCa通道的活动则使细胞膜超极化，血管舒张。由于BKCa电导大，使得在较少通道被激活的情况下即可引起较大的超极化。因此，我们推测重症失血性休克血管低反应性与BKCa密切相关。细胞膜上几个或数十个BKCa同时激活形成自发性外向性电流（spontaneous transient outward current，STOC），研究发现脑血管平滑肌细胞中的局部钙离子浓度与STOC有关，并参与了血管平滑肌张力的负反馈调节过程[2]。钙火花是指肌浆网膜上一个或多个Ryanodine受体（RyR）共同活动所引起的钙释放的基本单位，它能够导致局部钙浓度的急剧升高。在心肌和骨骼肌细胞中钙火花直接介导细胞的兴奋－收缩偶联过程，在平滑肌细胞其功能较为复杂。因此，我们推测：休克后期细胞内局部钙即钙火花频率和幅度增加激活BKCa导致平滑肌细胞反应性的下降。 1.材料和方法

1.1 失血性休克动物模型的复制

取体重为170～220g的Wister大鼠（雌雄不拘），用13.3％乌拉坦＋0.5%氯醛糖（0.65ml/100g体重）肌肉注射麻醉，分离双侧股动脉和一侧股静脉分别用于测量血压、放血、回输血液和药品。将收缩压维持在40mmHg 约2 h，复制失血性休克大鼠模型。假手术组只做手术，不放血。 1.2 血管平滑肌细胞的分离

手术毕的动物断头处死，迅速剪取肠系膜取出肠系膜置于0℃无钙的HEPES缓冲液中（HPSS, mmol/L: NaCl 130, KCl 5, MgCl 1.2, CaCl2 1.5, HEPES 10, Glucose 10, 用1mol/L NaOH调pH至7.4），剥离肠系膜动脉并弃去其周围脂肪组织，置于含木瓜酶（papain: Sigma, St. Louis）0.3mg/ml, 二硫苏糖醇（DTT: Sigma, St. Louis）1.25mg/L的无钙HPSS液中，37℃温浴消化25 min，然后再置于含胶原酶XI（collegenase XI, Sigma, St. Louis）1mg/ml的低钙（0.1 mmol/L CaCl2）HPSS液中37℃消化10min。用吸管轻轻吸走消化酶液，保留血管段，再沿壁缓慢加入0℃的低钙HPSS液冲洗2～3次，最后加入适量低钙HPSS液，用细头吸管轻轻吹打3～5次，即可得到大量单个血管平滑肌细胞。将细胞悬液置于4℃冰箱中，6～8 h内分别完成细胞内钙的测定和对血管活性物质的反应性的实验。 1.3细胞内钙及钙火花的测定

在细胞悬液中，加入钙指示剂fluo-4AM（细胞内钙测定，终浓度5μmol/L），室温避光孵育30至40min，用正常HPSS液反复冲洗3～4次后，置于共聚焦倒

置显微镜（Zeiss,德国）上，由氩离子激光器激发，在激发波长488nm、发射波长515nm条件下进行荧光强度检测，用xyt方式进行扫描，时间间隔5s，扫描时间为5min。分别记录基本荧光值（F）、加入5mmol/L EGTA螯合所有的细胞外钙离子时的荧光值（Fmin）和加入0.1%Triton使细胞内钙全部与指示剂结合时的荧光强度（Fmax），用下列公式计算细胞内钙离子浓度：〔Ca2+〕i（nM）＝K*（F－Fmin）/（Fmax－F）其中K为400。代表Fluo-3与钙离子的结合解离常数。结果用IDL（interactive data language，Reserch System Co.）中的用户自编程序（由北京大学生命科学学院生物膜与膜生物学国家重点实验室提供，稍作修改）进行脱机处理。钙火花的幅度大小用F/F0表示。F为钙火花区域的荧光值。 1.4数据统计和分析

数据结果统计及其差异显著性检验用SPSS11.0独立样本t检验（两组）、非参数检验采用两独立样本秩和检验进行。统计结果用均数±标准误（Mean±SE）表示，作图用Origin7.0进行。P<0.05认为差异有显著性意义。 2.结果

2.1.钙火花的特性

本实验用共聚焦显微镜成像技术观察了细胞内钙火花的自发性发放频率、持续时间和空间的分布，发现：ASMC中的钙火花多分布于靠近细胞膜的部位，提示它可能与细胞膜功能密切相关。钙火花的峰值（amplitude,F/F0）为1.27±0.01,时间半高宽（FDHM）为45.64±2.91ms,空间半高宽（FWHM）1.75±0.05μm。 2.2 失血性休克大鼠ASMC的钙火花的变化

共聚焦显微镜成像技术观察失血性休克2小时后，休克组大鼠钙火花的平均荧光值、平均时间半高宽、平均空间半高宽均比正常组大鼠高（P<0.05，两独立样本t检验）。

2.3 细胞膜电位的变化

采用细胞内记录方式，观察正常组和休克组细胞膜电位，休克组细胞的膜电位比正常组的膜电位低(图1)。在正常组和休克组加入大电导钙激活钾通道BKCa的特异性阻断剂IBTX，正常组膜电位变化不大，休克组膜电位显著降低。说明失血性休克2小时后休克组细胞膜电位降低与大电导钙激活钾通道BKCa密切相关。 3.讨论

本实验中，休克大鼠平滑肌细胞中钙火花的荧光值较正常大鼠高，说明肌浆网内的钙水平增高。钙火花的振幅也增高，也证明了肌浆网内的钙离子浓度可以影响钙火花的幅度。另外，失血性休克2小时后，在正常组和休克组加入大电导钙激活钾通道BKCa的特异性阻断剂IBTX后，正常组膜电位变化不大，休克组膜电位却显著降低，说明大电导钙激活钾通道BKCa可能参与细胞膜的超极化，因为电导钙激活钾通道的激活依赖于钙离子，所以RyR介导的钙火花释放的增加可能是导致BKca激活，进而导致血管反应性下降的重要原因之一。

参 考 文 献

[1] Stekiel W,Wiliems W,Harder D,et al:Active vascular smooth muscle tone and venous membrane potentials during hemorrhage[J].Am J Physiol 1980；238:H144-152.

[2] Munujos, P.， Knaus, H., Kaczorowski, G.J., and Garcia, M.L.(1995). Crosslinking of

charybdotoxin to high-conductance calcium-activated potassium channels: identification of the covalently modified toxin residue[J]. Biochemistry 34:10771–10776.