贝伐珠单抗原液生产车间工艺设计
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贝伐珠单抗原液生产车间工艺设计
摘 要
贝伐珠单抗是一种抑制血管内皮生长因子的人源化的单克隆抗体，广泛适用于转移性结直肠癌和晚期、转移性肺癌等多种肿瘤的治疗。现如今不断对贝伐珠蛋白药物以及更多适应症的深入研究，贝伐珠单抗将成为重要的抗肿瘤血管生成药物，其蛋白药物将需要大规模工业化生产来满足市场需求。本论文通过查阅贝伐珠单克隆抗体的生产工艺，利用分批补料方法对CHO细胞进行发酵培养并对贝伐单抗原液生产进行车间设计。本设计主要为发酵和纯化车间的设计，包括物料衡算、热量衡算、厂房设计及设备选型等。
关键词：贝伐珠单抗;生产工艺; 物料衡算；厂房设计
PROCESS DESIGN OF BEVACIZUMAB RAW SOLUTION
PRODUCTION WORKSHOP
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Abstract
Bevacizumab is a humanized monoclonal antibody that inhibits vascular endothelial growth factor. It is widely used in the treatment of metastatic colorectal cancer, advanced and metastatic lung cancer and other tumors. Nowadays, bevacizumab will become an important anti-tumor angiogenic drug due to the continuous in-depth research on bevacizumab and more indications, and its protein drug will need large-scale industrial production to meet the market demand. In this paper, the production process of bevacizumab was reviewed, and the CHO cells were fermented and cultured with batch feeding method, and the production workshop of bevacizumab was designed. This design mainly for fermentation and purification workshop design, including material balance, heat balance, plant design and equipment selection.
Keywords: bevacizumab；production process；material balance；plant design
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目 录
1前言 ............................................................................ 1 1.1简介 ........................................................................ 1 1.2贝伐珠单抗在肿瘤治疗领域的应用 ................................................ 1 1.2.1 结直肠癌 ................................................................. 1 1.2.2卵巢癌 .................................................................... 1 1.2.3 胃癌 ..................................................................... 2 1.2.4 非小细胞肺癌 ............................................................. 2 1.2.5其他肿瘤 .................................................................. 2 1.3用药不良反应 .................................................................. 2 1.4 贝伐珠的发展概况 ............................................................. 3 1.5展望 .......................................................................... 4 2贝伐珠单抗工艺流程设计 ............................................................ 5 2.1生产工艺流程 .................................................................. 5 2.2生产工艺流程说明 .............................................................. 6 2.2.1药物原液（DS） ............................................................ 6 2.2.2药物制剂（DP） ........................................................... 11 3工艺计算 ......................................................................... 13
3.1生产周期 ................................................................... 13 3.2贝伐珠单抗原液基础数据及工艺指标 ............................................. 13 3.3贝伐单抗原液车间的物料衡算 ................................................... 14 4热量平衡计算 ..................................................................... 17 4.1热平衡方程 ................................................................... 17 4.2发酵工序热量衡算 ............................................................. 17 4.2.1发酵罐空消蒸汽用量 ....................................................... 17 4.2.2种子罐空消蒸汽用量 ....................................................... 18 5水平衡计算 ....................................................................... 20 6氧气物料平衡 ..................................................................... 21
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7主要大型设备选型 ................................................................. 22 7.1发酵罐及种子罐的选择 ........................................................... 22 7.2其他设备主要参数 ............................................................. 22 8总结 ............................................................................. 26 参考文献 .......................................................................... 27 谢 辞 ............................................................................ 28 附录 .............................................................................. 29
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1前言
1.1简介
贝伐珠单抗注射液是用于抑制血管内皮生长因子的一种人源化的单克隆抗体，用于联合化疗作为转移性结直肠癌、转移性乳腺癌、晚期非小细胞肺癌、转移性肾细胞癌的一线治疗方案[1,2]。
贝伐珠单抗的药理作用与机制：贝伐单抗可以通过选择性地与人体内血管内皮生长因子（VEGF）细胞相结合作用来有效减弱或阻止生长因子与VEGF细胞受体的相互结合，起到帮助肿瘤化疗药物更好地直接到达肿瘤内部或细胞间,最终有效地抑制了肿瘤内部血管的新生和细胞再生,从而充分发挥化疗持续抑制肿瘤血管生长的重要的作用[3]。
贝伐珠单抗特点：
1、广谱：贝伐珠单抗在新生肿瘤血管生成具有针对性抑制能力 2、半衰期长:贝伐单抗相比较其他药物下半衰期较长，大约20d 3、无交叉耐药:不受细胞毒性药物耐药性影响
1.2贝伐珠单抗在肿瘤治疗领域的应用 1.2.1 结直肠癌
据2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[4]显示结直肠癌在全国发病率、死亡率分别排第４、５位。虽然结直肠癌可以通过手术切除，仍有20%-30%患者手术后出现复发或转移情况。加上国内暂无全国性的结直肠癌筛查方案，导致大部分结直肠癌患者在就诊时己经发生转移[5]。与以往的化疗和放疗为主治疗手段相比，贝伐珠单抗的出现与使用，在一线治疗方案中联合基础化疗贝伐珠单抗显著延长患者的总生存期和无进展生存期，并在二线治疗、维持治疗中，贝伐珠单抗均能给患者产生显著疗效。
1.2.2卵巢癌
随着若干项大型Ⅲ期临床研究数据证实在标准化疗方案的基础上联合使用贝伐珠单抗，不但能够提高患者的临床缓解率，延长生存时间，而且未明显增加不良反应的发生
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率[6,7]。贝伐珠单抗逐渐得到认可，为耐药性卵巢癌和复发性卵巢癌的治疗带来了新的曙光。
1.2.3 胃癌
在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位，而临床收治的胃癌患者大部分为晚期，每年约60万的患者因胃癌死亡。付红伟[8]研究发现贝伐珠单抗的联合治疗和单纯化疗相比，对胃癌患者疾病控制率有所收益，无严重不良反应发生。所以，贝伐珠单抗联合化疗是可以考虑的方案，为晚期胃癌患者治疗增加了选择。
1.2.4 非小细胞肺癌
贝伐珠单抗联合铂类是首个被临床证实与基础化疗方法联用可延长晚期非鳞非小细胞恶性肺癌（NSCLC）患者生存期的血管生成抑制剂[6]。在多项成功的临床研究证实了贝伐珠联合铂类化疗能显著地延长肺癌患者的肿瘤生存期,使得贝伐珠单抗在晚期肺癌的治疗中继续占据重要的地位。但由于目前缺乏明确的临床疗效预测和影响因子,这一问题成为了贝伐珠单抗在其使用的过程和治疗中的一个关键性问题。
1.2.5其他肿瘤
多项临床研究显示贝伐珠单抗的联合治疗在乳腺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤等其他癌症应用上均有一定疗效，这给了临床上除了化疗外而一直没有更好的治疗选择的癌症的诊治带来了新的希望。但贝伐珠单抗在这些癌症上尚处于起步阶段，并没有明确的证据证实它能延长患者总生存期，在联合用药、治疗时机及远期疗效等问题，需要进一步研究。
1.3用药不良反应
由于应用贝伐珠单抗会抑制VEGF，但VEGF在正常组织的生理活动中发挥重要作用，所以会导致一些反应程度轻微的不良反应发生，如高血压、蛋白尿等是常见的不良反应,对症处理即可[6]。但对于严重威胁人体的不良反应需加大关注。
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1. 蛋白尿
在接受贝伐珠单抗治疗中，可能会因为单抗抑制VEGF而导致肾小球的滤过屏障受损，蛋白尿的发生与贝伐珠单抗的剂量相关。所以根据检测出尿蛋白水平来判断是否中止相关贝伐珠的治疗方案。 2. 高血压
通过对使用贝伐珠单抗治疗患者的观察，发现高血压的出现是常见的不良反应之一。故在使用贝伐珠单抗治疗的过程中，监测出血压达到正常临界值以上，一般只需的服用抗高血压药物，就可以对高血压进行充分的控制。 3. 血栓
与采用单独化疗的患者进行比较,患者在治疗中接受贝伐珠单抗和化疗的联合治疗后,可能会大大增加了静脉血栓发生的几率。如果在治疗中发生了可能威胁到患者生命的静脉栓塞发生的事件,应该立即停用贝伐珠单抗。 4. 其他
使用贝伐珠单抗后可能导致伤口愈合缓慢、伤口开裂、致死性出血的概率会增加，出现严重及致死性手术并发症的患者应暂停使用贝伐珠单抗。
1.4 贝伐珠的发展概况
贝伐珠单抗的原研药企是罗氏（基因泰克），在2004年获得FDA批准上市。于2017、2019年FDA先后批准安进和辉瑞公司生产贝伐珠单抗生物类似物Mvasi和Zirabev；2019年12月中国国家药监局批准齐鲁药业研制的贝伐珠单抗注射液上市，国内还有较多药企已经进入NDA、临床三期阶段，见表1。
随着不断对贝伐珠的研究，其在抗血管生成治疗领域中逐渐成为不可缺少单抗药物。现如今使用贝伐珠单抗治疗的患者超过100万。
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公司名称 信达生物 百奥泰 复宏汉霖 嘉和生物 恒瑞医药 正大天晴 华兰生物 神州细胞 安科生物 东耀药业 北京天广实 山东博安生物 适应症 NSCLC NSCLC CRC NSCLC NSCLC NSCLC NSCLC NSCLC NSCLC NSCLC NSCLC NSCLC 状态 NDA Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅲ 公示日期 2019.1 2019.12 2017.1 2017.12 2018.3 2018.7 2018.8 2018.12 2019.4 2017.5 2017.8 2018.1 表1.1中国进入临床Ⅲ期及递交NDA申请的贝伐珠单抗生物类似药
1.5展望
根据近几年的全球癌症报告显示，我国的新发癌症人数最多。2004年贝伐单抗成功研发且在癌症治疗领域起到重要作用，它的需求量在全球快速增加。但是在2019年之前贝伐单抗都是从国外进口，直到现如今齐鲁药业通过中国国家药监局批准生产贝伐单抗，大多企业仍处于临床阶段。因此，贝伐单抗在工业上的生产具有研究意义，本论文旨在研究贝伐珠单抗原液车间工厂设计，为实际工业生产提供参考价值。
本论文希望通过对发酵、纯化车间设计、设备选型等，能设计出比较符合实际生产的贝伐单抗车间,让生产效益最大化。随着对联合化疗、分子靶向治疗及多种治疗手段的不断探索，我相信贝伐珠单抗将成为癌症治疗领域上重要支柱。
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2贝伐珠单抗工艺流程设计
2.1生产工艺流程
贝伐珠生产工艺流程参见下图。
种子细胞种子复苏缓冲液阴离子交换层析L4培养基细胞扩增缓冲液阳离子交换层析L5压缩空气、氧气细胞培养注射用水病毒过滤L6注射用水离心过滤L1注射用水超滤浓缩L7缓冲液蛋白质捕获L2注射用水原液收获L8注射用水pH调节剂病毒灭活L3图2.1 DS生产工艺流程检验液
注射用水注射用水制剂配料灌装冻干、压盖灯检、包装存储L9L10L11图2.2 DP生产工艺流程
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2.2生产工艺流程说明 2.2.1药物原液（DS）
药物原液（DS）生产工艺流程可分为上游和下游两部分，其中上游工艺为从种子复苏到蛋白捕获，下游工艺为从纯化到原液收获。
2.2.1.1种子复苏
将种子细胞从种子库中取出冻存管，37Ⅲ下水浴解冻，并不断的摇动，使之迅速融化。用酒精消毒后打开，用移液枪吸出细胞的冻存液，加入事先装好培养基(37Ⅲ预热，8～10倍体积)的离心管内以稀释二甲基亚砜（DMSO），移液枪吹打成细胞悬液，然后在1000rpm下离心5min，去除上清液。接种于含少量培养基（约30ml）的一次性摇瓶中，在37Ⅲ、5％CO2 及饱和湿度下培养1h，使细胞复苏。
应用的培养基为Gibco公司生产货号为670006的CHO Medium，规格为10kg/桶的粉末状培养基。该培养基是一种不含动物来源成分的配方，适用于研究和生产应用分批工艺、补料分批工艺和量产工艺的各种生物培养容器。
CHO培养基基础配制方法: 称取培养基26.0g于含有950ml注射用水的烧杯, 缓慢搅拌使其溶解；然后加入1.9gNaHCO3;再次搅拌溶解，加注射用水定容至1L（所需pH可用NaOH或HCl溶液调节）；在0.2μｍ滤膜中正压过滤除菌。
2.2.1.2细胞扩增
复苏的细胞接种于培养基培养经过初步培养后，置于多个含培养基一次性摇瓶中培养悬浮培养，（形成约900ml的细胞液）接种密度维持在0.3~0.5×106cells/ml，细胞活率维持在85％以上，在35Ⅲ下自然增殖分裂细胞数量pH控制在7.2~7.3，培养24h。
2.2.1.3一级反应器培养
待培养细胞经过扩增后转至10L的一次性生物反应器中，培养同时加入培养基，供细胞正常繁殖分化产生抗体，通入CO2和O2。考虑到实际操作过程中，种子制备体积过大会增加前期培养时间，使培养发生污染的机率增大[9]。所以确定反应器中的传代接种密度为3~6×105cells/ml。
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2.2.1.4多级反应器培养
采用培养方法为分批补料培养法，在不同培养时间段中添加补料培养基，一次性收获产品。
生物反应器培养分4阶段，分别是10L、50L、200L、2000L，每个阶段均需加入培养液（Gibco提供、型号670006），加入不同量的发酵液满足不同阶段的容量。种子密度达到3~6×105cells/ml接种，通常为2d左右。在37Ⅲ下扩增培养，第2天补充5%基础培养基体积的补料培养基（Sigma-Aldrich公司提供，型号24368C）；细胞密度达到4~6×106cells/ml，调整温度至30Ⅲ左右；第 4、6、8天分别补10%、10%、5%基础培养基体积的补料培养基；当细胞活力低于70%−80%中止培养。
10L、50L、200L反应器培养为种子细胞培养阶段，加入的培养液分别为7.5L、37.5L、150L;培养条件：温度为36℃−37℃，搅拌转速为120−180rpm，溶氧（DO）为30%−80%和pH为7.0-7.2，总培养时间为6d。
2000L反应器为细胞生长阶段的抗体分泌阶段，加入培养液（Gibco提供、型号670006）的量为1500L，总培养时间为20d。培养条件为：温度为30℃−32℃，溶氧（DO）为30%−80%、搅拌转速为60−90rpm 和pH为7.2-7.4,。
2.2.1.5细胞收获
在反应器中培养一定时期后，收集细胞和细胞产生的抗体，随后将进行一系列的过滤层析和提纯，得到所需要的抗体。
2.2.1.6离心过滤
将收获的含有细胞及产生抗体的细胞液通过采用离心的方式将浆细胞与抗体分离开并过滤，取上清液继续亲和层析。过滤条件为：温度25~28Ⅲ，时间约2～3h。过滤器在使用过程中会产生含细胞的冲洗废液L1，且细胞在离心过程中可能有部分会坏死，无论是否存活的细胞均被截留在过滤器中，成为固废。
2.2.1.7蛋白质捕获
先加入平衡液到层析柱上淋洗，再用分离得到上清液加样，然后用pH3.5洗脱缓冲液洗脱层析柱填料上结合的抗体，最后用较高浓度盐溶液去除强结合杂质，使得介质再
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生。将离心过滤后抗体通过亲和层析进行第一步的纯化，层析温度为18~26Ⅲ，层析时间约2～3h，过程中会产生有不含抗体的细胞、缓冲液废液L2。
具体步骤如下：①蛋白A介质填充于层析柱②层析柱由5cv平衡液清洗后上样，让样品在柱上保留4min③用3cv平衡液淋洗至A280基线，之后由5cv的缓冲液进一步冲洗，减少了亲和层析洗脱液中宿主蛋白的残留④再经2cv平衡液冲洗去除高浓度NaCl ⑤目标蛋白最后由5cv蛋白洗脱液洗脱，线性流速4mL/min，1min停留时间。⑥根据CEX-HPLC检测结果,合并收集样液，流速为2.0ml/min收集蛋白峰⑦最后用3cv的再生水冲洗层析柱再生，然后用3cv的消毒液冲洗层析柱，再用3cv的注射用水淋洗层析柱，保存在2cv的20%乙醇。 生产过程条件说明如下：
层析柱：Axichrom450/550（即内径450mm,高度550mm）,床层体积为87.4L
填料：rProtein A Sepharose Fast Flow(rPrA)，货号17-1279-03，通用电气公司GE。其每
毫升介质结合量为50mg，即需要60L的填料。
层析系统：AKTAprocess全自动可升级生产系统，型号AKTAprocess（GE公司） 操作系统：unicorn系统（GE） 溶液：
平衡液：50 mmol/LHEPES，150mmol/L NaCl，pH7.0 缓冲液：50 mmol/L HEPES，1 mol/L NaCl，pH7.0 蛋白洗脱液：100 mmol/L醋酸，pH 3.5 再生液：2mol/L NaCl 消毒液：50mmol/L NaOH
2.2.1.8病毒灭活
在生产过程中可能会有病毒产生，污染的来源可以是原细胞系本身，也可能来自过程中、培养基、缓冲液等原辅料[10]偶然带入的外源病毒。为确保产品的安全性，所以需要通过病毒灭活的步骤，现采用分离方法如下。 1. 低pH病毒灭活
使病毒处于低pH环境下，改变病毒表面电荷，蛋白质的空间结构发生不可逆的变性，病毒丧失与细胞受体结合的能力，起到病毒灭活作用。目前存在容器顶部和管道壁会有液滴未能接受很好的低pH病毒灭活的问题，考虑将混匀的溶液转移至另外一个容器。
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2. 纳滤膜
多数病毒直径在20~200nm，而纳米过滤膜的孔径平均为2nm,相对分子质量截留范围在在200~1000之间。利用膜内有大大小小孔径可进行筛分，对纳米膜进行加压来除病毒过滤。存在问题是小孔径的膜包被杂质堵塞，导致病毒从大孔径流出。
这里主要采用低pH灭活方法，用1.5倍注射用水稀释收集的样品，酸性溶液调节pH值至3.5左右，18−26℃下孵放 2−3h，完成病毒的灭活。根据下一步阴离子交换层析需要，用高浓度、高pH值的Tris-HCl调节蛋白溶液 pH 值至7.2左右，此过程会产生酸性废液L3。
2.2.1.9离子交换层析
1.阴离子交换层析
经过初步纯化后的抗体溶液继续进入阴离子交换层析装置进一步纯化，它是去除内毒素和核酸的常用方法之一。经查阅知贝伐株单抗等电点pI=8.25，故选择pH7.2 Tris-HCl缓冲液作为平衡和洗涤缓冲液。层析温度18~26Ⅲ,层析时间约2h，层析过程需要加入一定量的缓冲液,层析后有不需要的缓冲废液L4产生。
具体步骤如下：①将强阴离子交换树脂填充于层析柱②用5cv平衡液清洗层析柱后上样，样品在柱上保留4min③用3v平衡液淋洗至至洗出液pH接近中性，之后由5cv的缓冲液进一步冲洗④再用20cv的0%～50%梯度洗脱液洗脱未结合的目标蛋白⑤根据CEX-HPLC检测结果,合并收集样液，流速为2.0ml/min收集蛋白峰⑥最后用3cv的再生水冲洗层析柱再生，然后用3cv的消毒液冲洗层析柱，再用3cv的注射用水淋洗层析柱，保存在2cv的20%乙醇。 生产过程条件说明如下
层析柱：Axichrom450/550（即内径450mm,高度550mm）,床层体积为87.4L
填料：POROS™ 50 HS强阴离子交换树脂，货号为1255911，Gibco公司，其每毫升介
质结合量为64～91mg,取64mg，即需要47L的填料。
层析系统：AKTAprocess全自动可升级生产系统，型号AKTAprocess（GE公司） 操作系统：unicorn系统（GE） 溶液：
平衡液：2mmol/L Tris-HCl，pH7.2 洗涤液：20 mmol/L Tris-HCl，pH7.2
洗脱液：20mmol/L Tris-HCl +0～0.5mol/L NaCl，pH7.2 再生液：2mol/L NaCl 消毒液：50mmol/L NaOH
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2.阳离子交换层析
阳离子交换层析是对抗体液进行深度纯化,去除不需要的阳离子。在目的蛋白峰出来前立即换成低pH值的平衡液，从而在保证回收率的前提下去除大部分酸性杂质。层析温度18~26Ⅲ,层析时间约2h,层析过程需要加入一定量的缓冲液,层析后有不需要的缓冲废液L5产生。
具体步骤如下：①将强阳离子交换树脂填充于层析柱②用5cv平衡液清洗层析柱后上样，样品在柱上保留4min③用3cv平衡液淋洗至A280基线⑤再由1倍柱体积的洗涤液进一步冲洗，之后立即用3cv的平衡溶液洗涤层析柱④再用洗脱液洗脱5cv⑥根据CEX-HPLC检测结果,合并收集样液，流速为2.0ml/min收集蛋白峰⑦最后用3倍柱体积的再生水冲洗层析柱再生，然后用3倍柱体积的消毒液冲洗层析柱，再用3cv的注射用水淋洗层析柱，保存在2cv的20%乙醇。
生产过程条件说明如下
层析柱：Axichrom450/550（即内径450mm,高度550mm）,床层体积为87.4L
填料：POROS™ 50 HS 强阳离子交换树脂，货号为1335911，Gibco公司，其每毫升介
质结合量为57.0-75.3 mg,取57mg，即需要53L的填料。
层析系统：AKTAprocess全自动可升级生产系统，型号AKTAprocess（GE公司） 操作系统：unicorn系统（GE） 溶液
平衡液：20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH5.4 洗涤液：10mmol/L Tris-HCl，pH 7.8 洗脱液：50mmol/L Tris-HCl，pH8.2 再生液：2mol/L NaCl 消毒液：50mmol/L NaOH
2.2.1.10病毒过滤
为了避免纯化中外源性病毒引起单抗活性降低。这里采用纳滤方法进行病毒过滤，由GE公司提供DK8040F30型号的纳滤膜。,pH值在7.2~7.3范围,操作温度25~28℃,过滤时间约2～3h,滤膜冲洗过程中会产生冲洗废液L6。
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2.2.1.11超滤浓缩
病毒过滤后原液进行浓缩,将可能含有缓冲液等除去,提高原液中有效成分浓度。pH值在7.2~7.3范围,操作温度25~28Ⅲ,超滤时间约2～3h,超滤介质每次使用后需冲洗，清洗中会产生废液L7。超滤所用膜包（由默克公司提供，型号MC0HC10FS1）孔径选自30kD超滤膜。
2.2.1.12原液收获
为了避免微生物污染，单抗原液品生产的全过程要进行微生物控制，以达到无菌目的。除菌过滤器通过利用截留和吸附性截留的方法将液体或空气的细菌除去，过滤器在使用中需要利用一定量的注射用水进行冲洗,产生冲洗废液L8。
2.2.2药物制剂（DP）
药物制剂（DP）生产工艺是从制剂到成品存。原液经配料加入一定量的注射用水及缓冲液,经化验合格得到合格药液,在灌装机半加塞后送冷冻干燥机,箱体内冷冻干燥,水分合格后在冻干机内压盖,出冻干机后轧铝盖得成品,灯检合格的产品进入外包装间,在贴签机上贴签、装盒、装箱送仓库低温储存。待检合格后出厂。
2.2.2.1制剂配料
在除菌过滤后的抗体液加入相应的制剂配方配制成的原液即为成品原液,经过有效成分检验合格即可进行包装,过程中有极少量的检验液成为废液L9。
表2.1贝伐珠单抗注射液制剂配方 成分 贝伐珠单抗 α，α-双羧海藻糖 磷酸钠 聚山梨酯20 稀盐酸（1%） 注射用水 浓度 100mg 5.3mg 1.3mg 4.0mg 0.4ml 加水至4ml
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2.2.2.2灌装
购买的包装容器利用注射用水清洗,产生废液L10,然后采用灌装机进行灌装。
2.2.2.3冻干
将完成上一步流程的产品送入冻干机冷冻干燥,冻干的任务后清洗,产生废液L11。
2.2.2.4压盖
将无菌的盖子装入压盖机进料斗，压盖机必须有冻干机的卸载过程同步。
2.2.2.5成品检查
每批次通过统计抽样检查，确保西林瓶的完整性。
2.2.2.6包装
所有包装材料前都要适应至环境温度，以免操作过程发生冷凝现象。
2.2.2.7储存
包装完后，托盘将被拉伸包裹并转移至仓库冷冻间储存，直到质控完成后放。
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3工艺计算 3.1生产周期
具体见下表
表3.1工艺流程主要操作与生产周期
产品名称 序号 1 2 3 4 5 6 小计 主线操作 种子复苏、细胞接种与扩增 上游细胞培养 离心过滤 生产时间 24h 21~26d 2~3h 2~3h 2~3h 2~3d 24.3~30.4d 每周生产批次 2000L发酵罐培养到无菌过滤为17.8d~23.8d，其余生产过程可交替进行 DS 蛋白捕获 病毒灭活 下游纯化与无菌过滤 1 2 3 4 5 6 小计 制剂配料 灌装 冻干 3h 6h 24h 7h 24h 2h 2.8d 每批生产时间2.8d，两批间间隔19d DP 压盖 检查 包装
3.2贝伐珠单抗原液基础数据及工艺指标
参照《中华人民共和国劳动法》规定，设计生产天数300天，生产周期为17.8d~23.8d, 取中间值20.8d，故年生产批次为14个。
（1）生产天数 300天
（2）产品批产量 1500L×98%×2g/L=2940g （3）产品年产量 2940×14=41160g （4）发酵周期 20.8d
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（5）倒罐率 2% （6）发酵罐装液系数：75%
3.3贝伐单抗原液车间的物料衡算
1. 2000L发酵罐发酵液量
2000L×75%=1500L
式中 75%——酵罐装液系数
其中在2000L发酵罐培养过程中，需要加入的基础培养基的量为1010L，由200L种子罐接种到发酵罐的量为40L，第2d、4d、6d、8d分别要补料5%、10%、10%、5%的培养液，总计450L。
2. 种子液量
种子罐为10L、50L、200L，逐次放大培养。 （1）10L发酵罐发酵液量：
10L×75%=7.5L
（2）50L发酵罐发酵液量：
50L×75%=37.5L
（3）200L发酵罐发酵液量：
200L×75%=150L
3. 培养基耗用量 （1）种子复苏耗用量：
30ml×26g/L=0.78g
式中 26——为每升中加入溶解每克培养基的量 （2）细胞扩增耗用量：
900ml×26g/L=23.4g
（3）种子培养耗用量：
（7.5L+37.5L+150L)×26g/L=5070g
（4）发酵培养耗用量：
（1010L+40L）×26g/L+450L×26g/L =39000g
一批次CHO培养基耗用量：0.78g+23.4g+5070g+39000g=44094.18g
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4. NaHCO3的耗用量
44094.18g÷26g/L×1.9g/L=3222.27g
5. 消泡剂的耗用量
(195+1500)×0.1%=1695g
6. HEPES的耗用量
11.915×（10×60+5×60）=10723.5g
式中 11.915——HEPES的相对分子质量g/mol
7. NaCl的耗用量(Mr: 58.44g/mol) （1）缓冲液含NaCl量：
58.44×[（0.15×10×60+1×5×60）+0.5×47×20]=43245.6g
（2）再生液：
58.44×2（3×60+3×47+3×53）=56102.4g
一批次NaCl耗用量：43245.6g +56102.4g =99348g
8. 99.5%乙酸的耗用量
57.44μl×5×60=17.1ml
式中 57.44——配制1L 100mM乙酸需要99.5%乙酸的量
9. Tris的耗用量(Mr: 121.14g/mol) （1）阴离子交换层析：
121.14×0.002×8×47+121.14×0.02(5×47+20×47)=2937.9g
（2）阳离子交换层析：
121.14×0.01×1×53+121.14×0.05×5×53=1669.3g
一批次Tris耗用量：2937.9g+1669.3g=4607.2g
10. 36%盐酸的耗用量 （1）阴离子交换层析：
0.02×86×8×47+0.02×86(5×47+20×47) =290.22ml
式中 86——配制1L 1MHCl需要36%盐酸的量 （2）阳离子交换层析：
0.01×86×1×53+0.05×86×5×53=1185.08ml
一批次HCl耗用量：290.22ml +1185.08ml =1475.3ml
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11. 柠檬酸-柠檬酸钠的耗用量(Mr柠檬酸: 210.14g/mol ；Mr柠檬酸钠: 294.12g/mol) （1）柠檬酸的耗用量:
0.02×210.14×0.32×11×53=784.1g
（2）柠檬酸钠的耗用量:
0.02×294.12×0.68×11×53=2332g
12. NaOH的耗用量(Mr: 40.01g/mol)
0.05×40.01（3×60+3×47+3×53）=960.24g
13. 无水乙醇的耗用量
0.2×（2×60+2×47+2×53）=64L
表3.2贝伐珠单抗原液生产车间的物料衡算表 物料名称 CHO培养基/kg NaHCO3/kg 消泡剂k/g HEPES k/g NaCl/kg 99.5%乙酸/mL Tris/kg 36%盐酸/L 柠檬酸/g 柠檬酸钠/g NaOH/kg 无水乙醇L 阴离子交换树脂/L 阳离子交换树脂/L 注射用水/kg 年产单抗原液物料量 每批次物料量 44.09 每年物料量 617.26 45.08 23.8 150.08 1390.9 239.4 64.54 20.72 10.92 32.62 13.44 64 47 742 87238.62 3.22 1.7 10.72 99.35 17.1 4.61 1.48 0.78 2.33 0.96 64 47 53 6231.33
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4热量平衡计算
4.1热平衡方程
计算依据：
（1）间歇式生产热量衡算基本方程式
Q物料带入+Q热负荷=Q物料带出+Q热损失 （式4.1） （2）化学热量衡算一般方程式
Q1+Q2+Q3=Q4+Q5+Q6+ Q7+Q8 （式4.2）
式中：𝑄1—物料带入热量
𝑄2—由加热剂传给设备和所处理的物料的热量 𝑄3—过程的热效应，包括反应热、搅拌热（kJ） 𝑄4—物料带走的热量 𝑄5—加热设备消耗的热量 𝑄6—加热物料需要的热量 𝑄7—气体或蒸汽带出的热量
𝑄8—损失的热量
4.2发酵工序热量衡算 4.2.1发酵罐空消蒸汽用量
(1) 发酵罐体加热用蒸汽量
发酵罐体积2000L，在0.2MPa蒸汽(表压)下灭菌，从20Ⅲ加热至127Ⅲ，时间为1h。其蒸汽用量为：
D加热=
600×0.5×（tw−t1)×1kcal
(I−t2)×1kcal
600×0.5×（127−20）×4.18
（652−127）×4.18
= =61.1kg （式4.3）
式中 600——发酵罐罐体重量kg
0.5——发酵罐为的不锈钢比热容kJ/(kg·Ⅲ) 1kcal——=4.186kJ
I——0.2MPa(表压)蒸汽焓kcal/kg
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(2)填充发酵罐空间所需蒸汽量
2m3发酵罐全容积大于2m3，考虑到罐内配件也占有一定罐内体积，罐体积依旧按2m3计算，填充空间所需蒸汽用量：
D填充= V发酵罐ρ蒸汽 =2×1.704 =3.4kg （式4.4） 式中
V—发酵罐自由空间即全容积(m3) ρ—加热蒸汽密度（kg/m3） (3)灭菌过程的热损失
设发酵罐由20℃升温到127℃，外壁温度为70℃，此时辐射与对流联合给热系数𝛼为
α=33.9＋0.19（70-20）=43.4[kJ/（m2•h•K）]
2m3发酵罐的表面积为6.3m2，消耗蒸汽量为： D损 =
S×α×（tw−t1)×1kcal
(I−t2)×1kcal
6.3×43.4×(70－20)×4.18
(652−127)×4.18
==26kg （式4.5）
(5)灭菌过程蒸汽渗漏，为总蒸汽消耗量的5%，空罐灭菌总体消耗量为
61.1+3.4+261－0.05
=95.3kg/h
(5)每空罐灭菌1h，用蒸汽量
95.3×1 =95.3kg/罐
4.2.2种子罐空消蒸汽用量
(1)同理，种子罐加热用蒸汽量
10L： D加热=50L： D加热=
10×0.5×（127−20）×4.18
（652−127）×4.18
=1.01kg
100×0.5×（127−20）×4.18
（652−127）×4.18
=10.18kg =26.48kg
200L： D加热=(2)填充发酵罐空间所需蒸汽量
260×0.5×（127−20）×4.18
（652−127）×4.18
10L： D填充= V种子罐ρ蒸汽 =0.01×1.704 =0.02kg 50L： D填充= V种子罐ρ蒸汽 =0.2×1.704 =0.34kg 200L： D填充= V种子罐ρ蒸汽 =0.5×1.704 =0.85kg
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(3)灭菌过程的热损失
10L： D损 =50L： D损 =
0.25×43.4×（70－20）×4.18
（652−127）×4.18
=1.03kg
3.14×43.4×（70－20）×4.18
（652−127）×4.18
=12.96kg =12.67kg
200L： D损 =
3.07×43.4×（70－20）×4.18
（652−127）×4.18
(4)灭菌过程蒸汽渗漏，为总蒸汽消耗量的5%，空罐灭菌总体消耗量为
10L： 50L：
1.01+0.02+1.03
1－0.051－0.05
=2.17kg/h =24.72kg/h =42.11kg/h
10.18+0.34+12.96
200L：
26.48+0.85+12.67
1－0.05
(5)每空罐灭菌1h，用蒸汽量
10L： 2.17×1 =2.17kg/罐 50L： 24.72×1 =24.72kg/罐 200L： 42.11×1 =42.11kg/罐
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5水平衡计算
注射用水的用量计算主要用于发酵车间和纯化车间，考虑到在其他具体的工艺上注射用水大部分用于仪器的冲洗且在生产过程中有用水的损耗，故取这些注射用水消耗量之和等于发酵车间和纯化车间用量的10%。 1.发酵车间耗水量
发酵车间的耗水量为等于扩增是需要培养液、发酵液和种子液的体积。
0.03+0.9+1500+190=1695.93（kg/批）
2. 纯化车间水的耗用量 （1）蛋白捕获水的耗用量
主要为亲和层析所需配置缓冲液、消毒液、再生液、冲洗亲和介质使用注射用水的量。
6cv平衡液+5cv缓冲液+3cv洗脱液+3cv消毒液+3cv冲洗
=600+300+180+180+180=1440（kg/批）
（2）阴离子交换层析
离子交换层析耗水量大致与亲和层析耗水量计算步骤一样，除了离子交换层析所用的平衡液为 Tris-HCl溶液，配置中HCl溶液是直接购买使用。
（8cv平衡液+5cv缓冲液+20cv洗脱液-HCl溶液）+3cv消毒液+3cv冲洗
=（376+235+940-0.29）+141+141=1832.7（kg/批）
（3）阳离子交换层析
11cv平衡液+（1cv缓冲液+5cv洗脱液-HCl溶液）+3cv消毒液+3cv冲洗
=583+（53+265-1.19）+159+159=1217.81（kg/批）
3.注射用水每批消耗量
（1695.93+1440+1832.7+1217.81）×（1+0.1）=6805.1（kg/批）
4. 注射用水年消耗量
6805.1×14=95271.18（kg/a）
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6氧气物料平衡
归纳发酵车间的氧气物料平衡，我们可以简洁的总结为所通入发酵反应器的所有氧气都被细胞消耗掉了，除了从尾气中排放出去的氧气。
𝑄=发酵罐体积×通气速率×填充系数=2×75%×0.65=0.975(𝑚3/ℎ) （式6.1）
𝑂𝑈𝑅=
𝑄(𝑐𝑖𝑛−𝑐𝑜𝑢𝑡)
𝑉
（式6.2）
式中 0.65——2000L规模的通气发酵罐的通气速率vvm
𝑂𝑈𝑅−耗氧速率 [𝑚𝑜𝑙𝑂2/(𝑚3·ℎ）]
𝑄−通气量 (𝑚3/ℎ）
𝑐𝑖𝑛−通入发酵罐的空气氧浓度（𝑚𝑜𝑙𝑂2/𝑚3) 𝑐𝑜𝑢𝑡−离开发酵罐的空气氧浓度(𝑚𝑜𝑙𝑂2/𝑚3) V−通发酵罐装液量（m3）
通常，𝑐𝑖𝑛就是大气的氧浓度9.69𝑚𝑜𝑙𝑂2/𝑚3，而𝑐𝑜𝑢𝑡可根据氧的利用率计算，且𝑐𝑜𝑢𝑡=0.85~0.9𝑐𝑖𝑛 。取𝑐𝑜𝑢𝑡=0.85𝑐𝑖𝑛，可得
0.15×9.69×0.975
𝑂𝑈𝑅==0.95[𝑚𝑜𝑙𝑂2/(𝑚3·ℎ）]
1.5
二氧化碳的物料平衡计算涉及加入培养液中缓冲体系中CO3-的浓度、细胞呼吸、通入CO2量，计算比较麻烦，故不做详细计算，实际操作主要根据中监测溶液pH值高低来确定通入CO2的量。
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7主要大型设备选型
7.1发酵罐及种子罐的选择
根据所述生产工艺流程，选择种子细胞的培养及抗体分泌的反应器为GE Healthcare提供的XDR一次性生物反应器。反应器的具体规格如表7.1所示：
表7.1生物反应器参数
生物反应器 罐内径 H/D 叶轮 叶轮直径 pH范围 DO范围 温度范围 搅拌（rpm) 宽（cm) 厚（cm) 高（cm)
10-800 32 35 88 5.4 XDR-10 8 1.5
XDR-50 12 2.5
XDR-200 22 1.5
XDR-2000
48 1.5
底部锚定、磁力驱动的一次性叶轮，整合反应袋装置
8.5
8.5
16.5
2-12pH值单位，准确度±0.5pH单位 0-200%大气饱和，准确度±0.1%
4-60℃,准确度±0.1℃ 0-360 111 71 187
0-360 133 94 216
0-115 180 155 357
7.2其他设备主要参数
1.工业层析系统ÄKTAprocess的主要参数，如表7.2所示
表7.2ÄKTAprocess层析系统参数
系统规格 内径9.4 mm，不锈钢 波长范围 pH 范围 电导范围 最大操作压力 长 × 宽 × 高（mm） 系统参数 13-600 L / h 单波长为280 nm 0-14 1-200 mS / cm 0.3兆帕 1205 × 850 × 1670
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2.AKTA flux过滤系统的主要参数，如表7.3所示
表7.3层析过滤系统参数
一般规格 尺寸 (L× b× h) 储液罐体积 相数 管路尺寸mm 物料流量范围 输送流量范围 滤出流量范围 滞留体积 ÄKTA flux 6 680×520×800mm 8 L 单相 内径 6.4 × 外径 12.7 100-6000 mL/min 20-1000 mL/min 20-1000 mL/min 120 mL
3.三足离心机的主要参数，如表7.4所示
表7.4离心机参数
产品类型 型号 直径mm 高度mm 拦液般口径mm 转速图r/min 工作容积L 装料极限kg 分离因数W2R/g 尺寸mm(L× b× h) 三足离心机 SS1500 1500 450 600 360 400 300 3200 2640× 1850× 1100
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4.二氧化碳箱的主要参数，如表7.5所示
表7.5二氧化碳箱参数
产品类型 型号 温度范围 CO2控制范围 CO2进气过滤效率 内部增湿水盘 相对湿度 外型尺寸mm 内腔尺寸mm 不锈钢隔板 水套式二氧化碳箱 IL-185VT 185L 0-20% 99.998% 3L 95±3% 660×640×1105 540×505×680 4块
5. 双扉净化干热灭菌柜的主要参数，如表7.6所示
表7.6干热灭菌柜参数
产品类型 型号 内腔尺寸mm （宽 × 深 × 高） 外形尺寸mm （宽 × 深 × 高） 循环风量变频调节最大（m³/h） 补充风量变频调节最大(m³/h) 冷却水用量（kg/ 批） 双扉干热灭菌柜 DMH-5A 1000× 1800× 1400 2100× 2150× 2500 5600 504 300
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7.3车间平面布局
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8总结
本设计贝伐珠单抗体选用CHO细胞株发酵培养，采用商业化培养基为原料进行分批流加培养。根据选定2000L发酵罐及每批次生产时间计算出年产41.16kg单抗原液。为了保证生产水平和缩短发酵时间，发酵车间的主要流程是是将复苏的种子细胞经过细胞扩增后在10L、50L、200L、2000L生物反应器逐级放大培养。最后对发酵液通过一系列纯化工艺来提高蛋白浓度，减少内毒素、核酸、ProteinA 和宿主蛋白等杂质污染风险。
经过物料衡算，确定按照每年产量41.16kg单抗原液，每14天投放一个批次。每批次投料量102.6kg，每批次得到产品为1470L单抗原液。
本设计进行了热量衡算，反应要的热量主要为发酵罐、种子罐空消耗热，需要蒸汽用量为2160.2kg/a; 经水平衡计算，耗水量主要为发酵车间及纯化车间，需要注射用水为87238.62kg/a；经无菌压缩空气在发酵过程中衡算，发酵车间氧气耗用速率0.95 [molO2/(m3h)] 。
通过本次课题研究，我对贝伐珠蛋白药物生产和我国贝伐珠单抗目前的状况，以及将来的发展趋势，都有了进一步了解，特别是对发酵法生产单抗原液和单抗原液生产的发酵车间有了更深的了解。
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参考文献
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谢 辞
在本次毕业设计中，我将所学过的工程制图、制药工艺学、生物工程工厂设计概论等知识进行了综合运用，使所学的理论知识和基本技能得到进一步的巩固和加深。在设计中，对 AutoCAD软件的学习和使用、流程设计、工艺计算以及设备的设计选型使我对车间设计进行了进一步的了解。
这次的毕业论文设计总结是在我的指导老师王莹老师亲切关怀和悉心指导下完成的。从毕业设计选题到设计完成，有了老师给予了耐心指导与细心关怀我才不会在设计的过程中迷失方向，感谢王莹老师给予了我这样一个学习机会。
感谢与我并肩作战的舍友与同学们，感谢关心我支持我的朋友们，感谢学校领导、老师们，感谢你们给予我的帮助与关怀; 特别感谢学院四年来为我提供的良好学习环境，谢谢！
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附录
溶液液配置 1. 50mM HEPES :
11.915 g HEPES 溶解在800ml蒸馏水中，加0.5~1M 的NaOH水溶液调节至少所需pH(HEPES的有效pH 范围是6.8~8.2)，然后用蒸馏水定容至1000ml，于4摄氏度保存。
2. 150Mm、1M NaCl
8.766g的NaCl颗粒溶解于990ml蒸馏水中, 然后用蒸馏水定容至1000ml;同理将58.44gNaCl颗粒溶解于990ml蒸馏水中, 然后用蒸馏水定容至1000ml。 3. 100mM醋酸
99.5%的乙酸浓度是17.41mol/L=1000*1.05*99.5%/60，所以配制1000ml 100mM 乙酸：0.1M*1000 ml/17.41M=5.744ml，即取5744ul 99.5%乙酸到1000ml ddH2O中，即为100 mM。
4. 0.05M Tris-HCl
取500ml 0.1M Tris置于1L烧杯，加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解，根据pH值调节所需要盐酸量。pH7.2加入0.1M盐酸约270mL,加水定容至1000ml; pH7.8加入0.1M盐酸约85mL, 加水定容至1000ml;pH8.2则需要取250ml 0.2M Tris与225ml 0.2M盐酸, 加水定容至1000ml。 5.10mM Tris溶液
Tris需称量1.21g Tris(121.14g/mol)置于1L烧杯，加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解，最后定容至1L。 6. 1M HCl
用量筒量取86 mL36%盐酸倒入烧杯，用蒸馏水溶解后用玻璃棒引流注入1L容量瓶, 洗涤烧杯和玻璃棒,引流注入容量瓶中，然后向容量瓶中加水至距离刻度线1至2cm,改用胶头滴管滴加，直到液面与刻度线相平，盖上塞子摇匀，装入试剂瓶。 7. 1M NaOH
准确称量40g氢氧化钠固体放入烧杯中,用330ml蒸馏水溶解，将冷却后的氢氧化钠溶液全部转移到1000ml容量瓶中，用蒸馏水洗涤烧杯和玻璃棒2-3次,将洗涤过的溶液全部放入1000ml容量瓶中，振荡均匀，最后定容至1L。 8. 20mM柠檬酸-柠檬酸钠
柠檬酸C6H8O7·H2O分子量:210.14， 0.02mol/L溶液为4.2g/L；柠檬酸钠 Na3C6H5O7·2H2O分子量:294.12,0.02mol/L溶液为5.88g/L；调节pH值为5.4需要0.02mol/L柠檬酸320ml, 0.02mol/L柠檬酸钠680ml。
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9. 20%乙醇
取无水乙醇200ml于容量瓶，再补加灭菌注射用水溶液至1L。
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