实验目的
1. 了解凝胶层析的原理及其应用。
2. 通过测量蛋白质分子质量，初步掌握凝胶层析技术。
3. 了解洗脱曲线、选择曲线的意义，并学会绘制洗脱曲线、选择曲线。
二、实验原理
(一)
蛋白质分子量的测定
蛋白质是生命过程中最重要的物质之一，近年来已成为生命科学领域的研 究热点⑴。分子量是蛋白质的主要特征参数之一，当发现一种新的蛋白质时， 首先应准确测定其分子量。蛋白质分子量的测定方法有多种，如渗透压法、光散 射法、超速离心法、凝胶层析法及聚丙烯酰胺凝胶电泳等 (二)
凝胶层析法
[2-4]
。
层析法，又称色层分析法或色谱法(Chromatography)，在1903-1906年由 俄国植物学家M.Tswett首先提出。虽然近年来质谱技术日益成熟,灵敏度、精确 度也为各种方法之首，但是目前在实验室中测量蛋白质分子量应用比较广泛的还 是凝胶层析等方法呵。
凝胶层析法(gel filtration
)，又叫凝胶过滤法、凝胶渗透色谱法(GPC )、
排阻色谱法、凝胶过滤色谱法(GFC)、分子筛层析法(molecular sieve
chromatography )等⑹，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。
凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，如同过筛可以把 大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在 适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物， 再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的 空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外， 从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
由于其分离条件温和、 样品回收率高、实验的重复性高、设备简便经济等 特点，是目前最广泛使用的生化物质的分离方法之一，是所有色谱技术中 最简单、条件最温和的方法，且完全是基于样品的分子量大小来进行分离的。
虽 然
其分离效果不及高效液相色谱，但可作为一种初步的分离手段使下一步的纯化 达到更好的效果⑺。 （三） 凝胶
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其内部具有很微细的多孔 网状结构。常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（
Sepharose），人工合成凝胶是葡聚糖（
agarose gel ，商品名 dextran，商品名为 SePhadex），
凝胶型号不同，孔隙度不同，但都不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小 有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应 的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大， 适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 （四） 测量方法
凝胶过滤层析，是一种分离不同大小分子的分配层析 质的分子在溶剂和限定孔径的凝胶固定相中被分配
，被分离物
，混合物随流动相流
经层析柱时，各种物质同时进行着垂直向下的运动和无定向的扩散运动 混合物中各物质因相对分子质量的大小不同而被分离
，这种方法操作简
因
便，费用较低，重复性好⑹。因其能像筛子一样筛分不同大小的分子，
此又称为“分子筛”。其具有许多良好的性能，因此在蛋白质的分离分 析中被广泛采用。经过不少人的实际应用和完善，该方法已经变成一种 可靠的测定高分子分子量的方法
[9]
。
，以Vt （ total volume ）表
将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积” 示。Vt由三部分组成，即
Vt=Vo+Vi+Vg。Vo称为“孔隙体积”或“外体
积”（outer volume ）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面 空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；
Vi为内
体积（inner volume ），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的 体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和 吸水后的重量求得； Vg为凝胶本身的体积。
而洗脱体积（Ve，elution Volume ）与Vo及Vi之间的关系为：
Ve=Vo+Kd - Vi
Ve是自加入样品时起，到组分最大浓度(峰)出现时所流出的体积；本 实验凝胶层析柱中填充的是交联葡聚糖，含有蛋白的溶液通过管柱时， 大分子的蛋白呈正态分布连续首先流出，会形成一个蛋白峰 品组分在二相间的分配系数，也可以说
[10]
o Kd为样
Kd是分子量不同的溶质在凝胶内
部和外部的分配系数，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大 小分布有关，而与柱的长短粗细无关。
Kd可通过实验求得：
Kd= ( Ve- Vo ) /Vi
上式中Ve为实际测得的洗脱体积；
Vo可用不被凝胶滞留的大分子物
质的溶液(带颜色为佳，便于观察，如血红蛋白、印度黑墨水等，分子 量约200万的蓝色葡聚糖-2000等)通过实际测量求出； 求得(g为干凝胶重，单位为克；
Vi可由g • WR
WF为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表
示)o因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱 体积Ve,就可算出它的
Kd值。
三、 实验器材
1 •试剂
(1) 标准蛋白质： 蓝色葡聚糖-2000 ( 200KD)，牛血清清蛋白(67KD)， 胰凝乳蛋白酶原(24.5KD )，CytC ( 13.7KD )，均为分析纯。
(2) 洗脱液：0.2mol/L Tris-HCI-KCI,pH7.5 取 0.5M KCl 20ml,0.2M Tris 25ml,0.1M HCI40.3ml, 至 100ml
(3) Sephadex G-75 2.
器材 (1)
(2 )紫外分光光度计 (3) 部分收集器 (4)
刻度试管
层析柱：柱管 1.2 x 50cm
再加 H2O定容
四、 实验步骤
1.
凝胶的选择与处理：本实验使用Sephadex G-75凝胶。商品凝胶
一般是干燥的颗粒，使用前需在欲使用的洗脱液中充分溶胀。即在沸水 浴中，将悬浮于洗脱液中的凝胶浆逐渐升温至近沸，一般
1〜2h即可完
成［11］。根据层析柱的体积和所选用的凝胶，膨胀后床体积计算所需凝胶 干粉的重量，然后倾入过量的洗脱液中，室温吸水膨胀。凝胶颗粒最好 大小均匀，这样流速稳定，结果较好。
2. 装柱：本实验所用层析柱的规格为
1.2 X 50cm。
(1) 将层析柱垂直装好，在柱内先注入 1/4〜1/5的水，出口处接上一 根长约1.5m，直径2伽细塑管，塑管另一端固定在柱的上端约 处。
然后打开机器，排出气泡。
(2) 随着下面水的流出，上面不断加凝胶，使形成的凝胶床面上有凝胶 的连续下降。 (3) 柱。
(4) 用眼睛观察柱内凝胶是否均匀，有否“纹路”或气泡。若层析柱不 均一，必须重新装柱。
3. 加样：加样之前先吸去柱管内的上清液，然后加样。等到所加的样 与凝胶界面相平时，连接恒压瓶、层析柱、部分收集器等装置。
4. 洗脱：待上述工作做好之后，开始洗脱。
洗脱时应严格控制 流速,
3mL收集洗脱
当凝胶沉积到柱的顶端约 6 cm处，可停止装
45 cm
以3 — 4分钟收集3ml液体为宜。然后用部分收集器按每管 流出液，各收集管于 280nm处检测A280值。
5. 洗脱曲线、标准曲线的制定 (1)按上述步骤依次加入蓝色葡聚糖
-2000 ( 200KD)、牛血清清蛋白
(67KD)、胰凝乳蛋白酶原 (24.5KD )和 CytC ( 13.7KD )，然后用 50 mmol/l
的KH2PO4-K2HPO4缓冲液溶液洗脱。待上一个样品在管柱中行进约 1/3
时再加下一个样。用部分收集器收集流出液体，然后用紫外分光光度计 于280nm处测定每管 A值，以管号或者洗脱体积为横坐标， 绘出洗脱曲线。
根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积 的对数(1gM)为横坐标，
Ve。然后以蛋白质分子量
A值为纵坐标
Ve为纵坐标，作出标准曲线。为了结果可靠，
应以同样条件重复次，取Ve的平均值作图。
1-2五、实验结果
1.洗脱曲线： 本实验共依次加入
4种分子量已知的蛋白质，分别为 A:蓝色
葡聚糖-2000 （ 200KD）、B:牛血清清蛋白（67KD）、C:胰凝乳蛋白酶原 （24.5KD、和 D:CytC （13.7KD ）。
每3 — 4分钟收集3ml液体为一管，共收集了 处测得的吸光度值 A值（即OD值）见表1 :
表1:每管洗脱液对应的 OD值
管号 ODfi 管号 ODfi 管号 ODfi 管号 ODfi 管号 ODfi 1 0.02 6 0.036 11 0.019 16 0.22 21 0.184 2 0.037 7 0.006 12 0.024 17 0.078 22 0.134 3 0.041 8 0.326 13 0.06 18 0.031 23 0.091 4 0.318 9 0.089 14 0.286 19 0.024 24 0.047 5 0.14 10 0.053 15 0.344 20 0.105 25 0.023 1 :
25管，每管在 280nm
因此，以管号为横坐标， OD值为纵坐标绘制的洗脱曲线见图
由表1算得4种样品的洗脱体积分别为
：
Ve（A:蓝色葡聚糖）=（3+0.5） x 3=10.5ml Ve（B:牛血清清蛋白） =（8-3-0.5） x 3=13.5ml Ve（C:胰凝乳蛋白酶原） =（15-7-0.5） x 3=22.5ml Ve（D:CytC）=（21-11-0.5） x 3=28.5ml 2.标准曲线：
以蛋白质分子量的对数（1gM）为横坐标，Ve为纵坐标,
作出标准曲线。
表2:各样品洗脱体积和 IgM值
样品 A B C D M 200000 67000 24500 13700 IgM 5.301 4.826 4.351 3.876 Ve 10.5 13.5 22.5 28.5 OD值
0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 -0.05
图1洗脱曲线
0.344
0.318
0.326
0.184
庐〒口
10 15 20
25 管号 30
图1:加入的4种分子量 已知的 蛋白质的洗脱曲线，由上图可知： 分别在第4、& 15和21管时出现峰值。
图2标准曲线图
Vc
5 3.000
3.500 000 4.500 亍 OQO
图2:加入的4种分子量已知的蛋白质的标准曲线 六、分析讨论
蛋白质是生命过程中最重要的物质之一，早已成为生命科学领域的研究热 点。而分子量是蛋白质的主要特征参数之一，故准确测定其分子量意义重大。
凝胶层析法在蛋白质分子量的测定方面，虽然不及聚丙烯酰氨凝胶 电泳的灵敏度及准确度高，但因其操作简便、试剂价格较为便宜等优势 而受到人们欢迎。
影响分子量测定准确性的因素众多，有一定的局限性。如缓冲液的 pH值、凝胶的型号、加样时间间隔、顺序，以及收集洗脱液的操作等等 都会对实验结果产生影响。
缓冲液的pH值在6-8时，所得的标准曲线的线性较为良好，本实验 所用的缓冲液的 pH值为7.5，在该范围之内，故在其他操作良好的情况 下所得的线性较为良好。
凝胶的型号对分离的准确性产生影响。比如
Sephadex G-100 和
Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱,前者可在前期去除相对分子质量较大的杂 蛋白，而后者的分离范围只有
1000-30000。我们的目标蛋白相对分子
质
量在 10000-200000 左右,故用 Sephadex G-100 或者 Sephadex G-75 可 得到较好的分辨率。
加样时间间隔、顺序对结果准确性的影响。本实验采取加入单一样品
的方法，按分子量由大到小加入，并且待上一个样品基本上快要走出柱 管时才加下一个样。分子量大的样品不能进入凝胶内部，在凝胶颗粒之 间的缝隙流出，因此速度最快。从大到小加样，可以保证前一个样品基 本上被分离出来，确保了会出现峰值，能得出较为准确的洗脱体积。
分光光度计使用波长为
280nm时，是蛋白和酚类物质最高吸收峰的
吸收波长，260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长。故本实验测定蛋白质的 分子量使用 280nm。
七、注意事项
1. 加样时按分子量由大到小加入，以便于出现峰值和计算洗脱体积。 2. 洗脱液的pH值应在6-8得范围内，以保证标准曲线的良好线性。 3. 加样之前应赶出管柱内的气泡，并在整个操作过程中都要保证不产生
气泡，否则洗脱速度很慢并且结果也不准确。 4. 收集洗脱液的速度应严格控制在每 5. 分光光度计使用波长为
280nm。
3 — 4分钟收集一管液体
(约3m)
6. 实验结束，及时清洗整理实验用品，经指导老师同意后才能离开实验
室。
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