琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。把DNA样品加入

到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。 一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。

二、仪器及试剂

1.仪器及耗材：

水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或parafilm、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、吸头等。

2.试剂及配制：

50×TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0） 配制1000 ml Tris 242 g 冰乙酸 57.1 ml

0.5 mol/L EDTA 100 ml

加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。高温高压灭菌，室温保存。

1×TAE缓冲液的配制：

称量20 ml的50×TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。 溴化乙啶贮存液：10 mg/ml 溴化乙啶 配制：100 ml

称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。将溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。室温保存。

6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。 配制：10 ml 溴酚蓝 25 mg

二甲苯青FF 25 mg 甘油 3 ml

用6×TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。-20℃保存。 其它试剂：DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖、

三、操作步骤

1. 制备1％琼脂糖凝胶(大胶用70ml，小胶用50ml)：称取0.7 g（0.5 g）琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml（50ml）1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。

2. 胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

3. 加样：在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。

4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60－100V，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

5.电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min，再用清水漂洗10 min。

6.观察照相： 在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。

四、常见问题及注意事项

1．配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。 2．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 3．电泳时应注意电源线路，预防触电。

4．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验室内使用。

5．紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。 6．DNA带形状模糊：DNA加样过多；电压太高；凝胶中有气泡。 7．质粒DNA的存在形式有3种，①共价闭环DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；②开环DNA（ocDNA），此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子；③线状DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带，它们的泳动速度为：cccDNA > 线状DNA > ocDNA。

1.琼脂糖凝胶电泳的准备和操作方法

1.1制备琼脂糖凝胶是应注意避免气泡

用缓冲液配制所需浓度的琼脂糖凝胶，水浴或微波炉中加热使琼脂糖完全融化，将溶液冷至55 ℃ ，用少量琼脂糖凝胶将玻璃板或有机玻璃板封边，放置样品梳（梳齿下端离玻璃板0.5 -1.0mm ）。接着将融化的琼脂糖凝胶溶液不间断地倒在玻璃板上或有机玻璃板模子中（厚度依样品浓度而定，须注意避免气泡混入） , 室温下自然凝固。待完全凝固后小心取出加样器，在电泳槽中加入适量电泳缓冲液，使胶板浸没在电泳缓冲液下约1mm 处。

1.2样品制备与加样

所加样品应有适当浓度与较小体积，用微量注射器缓慢加入样品，点样时电源必须处于关闭状态。为了指示电泳的距离，避免样品在电泳槽缓冲液中飘浮，常在制备好的样品中加入含有蔗糖或甘油以及指示剂（溴酚蓝、二甲苯青等）的 上样缓冲液。另外，样品中含盐量不能太高，否则电泳中会出现区带消失、前沿不齐等现象。样品中DNA 含量以每条区带的DNA 不少于0.1 μ g 为宜， DNA 浓度过高会使电泳区带变宽，泳动距离异常。

样品的用量由加样孔的体积决定，通常为10-50 μ g 。

1.3电泳

电泳温度视需要而定。对于大分子的分离，宜低温，电压应低（一般不超过5V/cm ）。普通电泳可在室温进行，电泳的电压为5-15V/cm 。

1.4染色—以DNA电泳为例

常用荧光染料溴化乙锭（ EB ）进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA 条带。EB 能插入DNA 分子中碱基对之间，使EB 与DNA 结合（超螺旋DNA 与EB 结合能力小于双链闭环，而双链闭环的DNA 与EB 结合能力小于线状双链DNA ）。将以染色的凝胶浸泡在1mmol/lMgSO 4 溶液中1 小时，可以降低未结合的EB 所引起的背景荧光，以提高检测的灵敏度。 EB染料有很多优点： 操作简便

多余的 EB 不干扰紫外线灯下的检测（因为只有结合了核酸的EB 才能显示荧光） 不会使核酸断裂（其他染料不易做到这一点） 灵敏度高，且对DNA 或RNA 均可显色

EB 可以加到样品中，并可随时用紫外线吸收追踪检查，染色之后还可用正丁醇提取除去EB 但必须注意，EB染料具有潜在的致癌性，应避免直接接触，使用时必须带手套。

1.5样品回收

常用有下列方法电泳结束后在紫外线下观察样品的分离情况，对需要的DNA 分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同方法进行回收。 （1）

电泳完毕后，于紫外线下切下需回收的DNA 区带，将凝胶条置于含有适量缓冲液的透析袋中，再放入电泳槽电泳30-60 分钟，使DNA 分子泳动 透析袋电洗脱法－本法适用于分子量较小的DNA 片段的回收。 到透析袋靠正极一侧的壁上，然后反向电泳30-60 秒，使贴在透析模上的DNA 分子泳动到袋PH 为8.0 的缓冲液中。吸出袋内的缓冲液并用正丁醇抽提或乙醇沉淀所需的DNA 分子。 （2）

采用低融点琼脂糖制备的电泳凝胶，电泳完毕后可在紫外灯下切下拟回收的DNA 区带，于65 ℃ 保温 10-20 分钟。胶条融化后，再用酚- 氯仿抽提，最后用95% 的冷乙醇沉淀抽提DNA 片段，此法回收率可达80% 。优点是可直接在融化的凝胶中进行各种酶反应。但操作时应严格控制融胶和电泳温度。 低融点琼脂糖法 （3）

用琼脂糖凝胶电泳将DNA 片段分离后，于紫外灯下在紧靠待回收DNA 片段前方切一裂隙，将条状DEAE 纤维素膜插入裂隙中，继续电泳直至带中所有的DNA 均转移至膜上。再用低粒子强度的缓冲液洗掉膜中杂质，然后在高离子强度的缓冲液中将DNA 洗脱下来，最后用酚- 氯仿抽提，乙醇沉淀DNA 分子。本法回收的DNA 纯度很高。

DEAE 纤维素膜法－本法适宜小于5kb 的双链DNA 分子的回收 此外，还有醋酸铵溶液浸出法、冷冻挤压法等。

目前琼脂糖凝胶电泳样品回收存在的问题主要有以下几方面：

（1） 绝大多数的琼脂糖混杂有硫酸盐多糖，它能与DNA 一起从凝胶中被抽提出来，这些物质是许多酶的强抑制物；可将回收的DNA 沉淀数次或采用超纯琼脂糖的方法解决这一问题。

（2）从琼脂糖凝胶抽提出DNA 的效率与其分子量有关。琼脂糖凝胶电泳可以十分有效地回收小于1kb 长度的DNA 片段。随着DNA 分子量增大，回收量则显著降低，片段大于20kb 时，回收率很难超过20% 。三 、在医学中的应用琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定、纯化DNA 片段的主要方法，目前主要用于重组基因的分离、鉴定、限制性酶切图谱分析、Southern 、Northern 、Western 杂交分析，以及PCR 产物的分离鉴定等。测定 CK 和CK-MB 是目前用于证实心肌损伤和心肌梗死早期诊断的指标之一。使用免疫抑制法测定CK-MB 易受CK-BB 和异常CK 的干扰，导致

CK-MB 测定假性升高。采用琼脂糖凝胶电泳可分离出三种CK 同功酶，分别为CK-MM 、CK-MB 、CK-BB 。当出现异常同功酶如巨分子CK 时，在电泳图谱上很易被发现，从而避免误诊。血清经琼脂糖凝胶电泳后，用胆固醇基质试剂均匀铺在凝胶表面，孵育一段时间，即可见清晰的蓝色条带，依次是高密度脂蛋白胆固醇、快前β脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇。凝胶片用冰醋酸固定、水洗、烤干后， 570nm 波长扫描, 即可确定各组分的百分率含量。根据血清总胆固醇值可求得这四种脂蛋白胆固醇值。

琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是D 半乳糖3 ， 6- 脱水

-L 半乳糖。许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在pH4.0 － 9.0 的缓冲液中是稳定的。由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度大于0.05 时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，如DNA 分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA （球形）不能进入胶中，相对迁移率为零，而同等大小的直线DNA （刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于零。脂蛋白可在不同的支持介质中进行电泳分离，但最常用的是琼脂糖电泳。电泳后用脂溶性染料使脂质部分着色，用光密度计扫描得出各部分脂蛋白的相对比例。异常脂蛋白血症分型时应参考血脂及载脂蛋白测定结果。

源自百度百科 原理

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据PH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的PH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

操作流程 准备干净的配胶板和电泳槽

注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 1、选择电泳方法

一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电

泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 2、正确选择凝胶浓度

对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。 3、适合的电泳缓冲液

常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。 4、电泳的合适电压和温度

电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 5、DNA样品的纯度和状态

是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。 6、DNA的上样

正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。TIANGEN公司DNA分子量标准每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带。 7、Marker的选择

DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。TIANGEN公司的DNA Marker条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。从而避免

HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。

8、凝胶的染色和观察

实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。TIANGEN公司的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。