人类 EGFR 基因突变荧光 PCR 检测试剂盒说明书
【产品名称】
通用名称：人类 EGFR 基因突变荧光 PCR 检测试剂盒
英文名称：Shuwen® Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR
【包装规格】
7 测试 /盒 【预期用途】
EGFR 是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因 c-erbB-1（HER-1）的表达产物。EGFR 的主要信号转导途径有：PI3K-PDK 通路，RAS-RAF-MEK-ERK- MAPK 通路， PLC-γ 通路，JAK-STAT 通路。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应 对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。EGFR 异常调节通过多种机制促进 细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其 中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是 EGFR 的基因突变和过度表达。
EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的 ATP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替 尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的 药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。外显子19上747-750位氨基 酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和2236_2250del15)最为 常见，占到外显子19缺失总数的75%；外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种 点突变（G719X）约占5%；外显子20的突变占1%左右。另外研究发现外显子20上的T790M突变与酪氨酸 激酶抑制剂药物的耐药性相关。
本试剂盒以肿瘤DNA为检测样本，提供EGFR基因突变的定性检测。本试剂盒仅为临床医生肿瘤靶向 治疗药物的选择提供参考，具体临床应用时须结合实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床 诊断的唯一依据。 【检测原理】
本试剂盒结合特异性引物和TaqMan探针技术，用实时荧光PCR方法检测DNA样品中的EGFR突变基因。 利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型的扩增，通过TaqMan探针对扩增产物进行检测， 使得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增，从而达到高检测特异性和高灵敏度。 【主要组成成分】
本试剂盒具体包含组分如表1
1 表
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 19-Del（1）检测反应液 19-Del（2）检测反应液 S768I检测反应液 20-Ins检测反应液 T790M检测反应液 L858R检测反应液 L861Q检测反应液 G719X检测反应液 外控检测反应液 r-Taq酶 阳性对照DNA 无菌超纯水
组分 份数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 体积(µL) 150 150 150 150 150 150 150 150 150 30 100 500 1
【储存条件及有效期】
避光，-20℃以下保存，避免反复冻融(不要超过5次)，有效期6个月。
【适用仪器】
ABI 7300，ABI 7500，ABI 7900，ABI StepOne，ABI StepOne Plus，Rotor-Gene Q
【样本要求】
本试剂盒可以检测从新鲜组织及FFPE组织中提取的DNA，DNA质量及浓度影响检测的特异性和灵敏 度。DNA的质量与样本保存时间、样本组成、DNA提取方法密切相关；而且所采集的临床样本中正常组 织细胞的混杂程度也不同，因此对样本做如下要求：
1、 新鲜标本的制备过程中，术后标本取下后应立即放入-20℃以下冰箱中保存；石蜡包埋组织制备过程
中，术后标本应在1 个小时内放入10％中性缓冲福尔马林溶液中固定，用量应为组织块的4-20 倍， 固定时间应在6-48 小时之间；
2、 新鲜组织样本，要确保含有肿瘤细胞大于1%，尽量减少正常组织、间质及坏死组织，推荐使用商业
化 试剂盒提取DNA(AXYGEN，QIAGEN等公司产品)。提取的DNA用分光光度计检测DNA纯度， A260/A280在1.6-2.0之间，如果不能立即检测请置于-20℃保存。
3、 FFPE组织样本，要确保含有肿瘤细胞，尽量去除坏死组织及石蜡边缘，推荐使用商业化试剂盒提取
DNA(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)。提取的DNA用分光光度计检测DNA纯度，A260/A280在1.6-2.0 之间，如果不能立即检测请置于-20℃保存。FFPE组织样本保存年限尚未超过3年。
4、 样本切片规格要求为：横切面面积至少6mm×6mm，厚度10µm，3片，如果切片面积小请适当增加切
片数。最终提取的DNA用100µL-200µL水溶解，分光光度计检测浓度后，稀释或浓缩成5-10ng/µL。
【检验方法】
本试剂盒可以进行5人份的检测反应，并为每个样本额外提供一个参照基因扩增反应，用于估测样本 实际DNA的浓度。建议每批次实验都检测一个阳性对照(positive control)和一个无模板阴性对照(NTC)。建 议根据实验条件进行分区操作，如样品处理区，反应液配制区等。具体操作步骤如下： 1. 2.
将试剂盒中所有组分冰上融化，涡旋混匀并短暂离心，放置于冰上。[注意：试剂盒中的所有试管在 开盖前均应短暂离心，以免粘在管口或管盖上的试剂在开盖时被污染。]
每批实验根据待检测样本数、一个阳性对照、一个阴性对照，同时计算并分别配制1-8号反应液。每 个反应液所需反应数 =待测样本数 + 2（一个阳性对照、一个阴性对照），而每个反应所需反应液 19.7µL，需r-Taq酶0.3µL，即从1-8号反应液中分别取（19.7×反应数）µL于对应编号的1.5EP管，再 分别加入（0.3×反应数）µL的r-Taq酶。[注意：由于取样误差，请根据情况适当多配置0.3个反应即可。 ] 3. 4. 5. 突变 1 2 3 4 5 6 将配制好的混合液轻轻充分混匀，并按照每管20µL分装到每个PCR反应管中。
然后向每个反应管中加入5µL待检测DNA、或阳性参照、或水(试剂盒提供)。待检测样本最佳浓度范 围为5ng/µL-10ng/µL，即每个反应管中有效DNA总量为25-50ng。
短暂离心消除反应管中的气泡，将PCR反应管放入PCR仪。样本在PCR反应板中的布局可参见表2
表2 建议布局
19- del（1） 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD 19- del（2） 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD 2
S768I 20-Ins T790M L858R L861Q G719X 外控 7
NTC
NTC
NTC
NTC
NTC
NTC
NTC
NTC
NTC
6.
打开操作软件，设置PCR扩增程序为
Stage1：95℃ 5min
Stage2：95℃ 20s，57℃ 32s ，5个循环
Stage3：95℃ 20s，60℃ 32s ，40个循环 收集FAM信号
注：如果使用ABI定量PCR仪，将“Passive Reference”设置为“None”, “reporter”设置为“FAM”，
“quencher”设置为“TAMRA”
【参考值】
检测结果判定：
1. 当 19-del(1) 19-del(2) S768I 20-Ins T790M L858R L861Q G719X 阳性 CT<28 CT<28 CT<30 CT<28 CT<28大 CT<28 CT<29 CT<28 于 CT≥28 CT≥29 CT≥28 阴性 CT≥28 CT≥28 CT≥30 CT≥28 CT≥28 界 则该样品为阴性或低于本试剂盒的检测下限。
2.
当样品CT值小于阴性临界值时，则该样品为阳性。
表3 结果判定
样品
CT值
于或等 阴性临 值时，
【实验结果的解释】
1. 2. 3. 4. 5.
阈值设定：针对ABI7500机型，对以上9种检测分别设定阈值，其中19-del(1) ,19-del(2)和G719X阈值 设定为12000，其他为30000
阴性无模板空白对照(NTC) 应无扩增曲线升起；否则表明此次实验结果无效，建议更换操作环境或 反应试剂，重新试验。（若只稍稍升起，但对结果判断无显著影响，则结果依然有效）
阳性对照Ct值一般小于25，参照基因体系的阳性对照CT值一般小于23，但须根据仪器型号等情况进 行判断。
CT值确定：建议对于一个突变检测体系应同时选择参照基因反应管，STD反应管，NTC和样品反应 管，一并划定阈值，从而得到外控CT值和样品的突变CT值。
参照基因CT值应控制在23之前，以用于评估反应体系中的DNA模板量。若外控CT值大于23，说明加 入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量太少，需重新提取或增大DNA加入量再做。(仅对全阴性结果 而言；若已经判断为阳性，结果仍然可靠)
3
附表： 突变 E746_A750del(1) E746_A750del(2) L747_P753>S E746_T751>I E746_T751>A E746_S752>D L747_A750>P L747_T751>Q L747_E749del L747_T751del L747_S752del L747_A750>P L747_P753>Q L747_T751>S L747_T751del L747_T751>P E746_T751del E746_S752>A E746_S752>V S768I H773_V771insH D770_N771insG V769_D770insASV T790M L858R L861Q 外显子 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 20 20 20 20 20 21 21 碱基变化 2235-2249 del 15 2236-2250 del 15 2240-2257 del 18 2235-2252>AAT del 18 2237-2251 del 15 2238-2255 del 18 2238-2248>GC del 11 2238-2252>GCA del 15 2239-2247 del 9 2239-2253 del 15 2239-2256 del 18 2239-2248>C del 10 2239-2258>CA del 20 2240-2251 del 12 2240-2254 del 15 2239-2251>C del 13 2236-2253 del 18 2237-2254 del 18 2237-2255>T del 19 2303G>T 2319-2320 ins CAC 2310-2311 ins GGT 2307-2308 ins GACAACGTG 2369C>T 2573T>G 2582T>A Cosmic ID 6223 6225 12370 13551 12678 6220 12422 12419 6218 6254 6255 12382 12387 6210 12369 12383 12728 12367 12384 6241 12377 12378 12376 6240 6224 6213 5号反应体系T790M 6号反应体系L858R 7号反应体系L861Q 3号反应体系S768I 4号反应体系 20-Ins 2号反应体系19- Del（2） 对应检测体系 1号反应体系 19-Del（1） 4
G719A G719S G719C 18 18 18 2156G>C 2155G>A 2155G>T 6239 6252 6253 8号反应体系G719X
5
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容