发酵工程试题及答案

1、前体 指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。

2、发酵生长因子 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子

3、菌浓度的测定 是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。

4、搅拌热 ：在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关

5、分批培养 ：简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。

6、接种量 ： 接种量＝移入种子的体积/接种后培养液的体积

7、比耗氧速度或呼吸强度 单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气，mmol O2?g菌-1?h-1

8、次级代谢产物 是指微生物在一定生长时期，以初级代谢产物为前体物质，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质过程，这一过程的产物，即为次级代谢产物。

9、实罐灭菌 实罐灭菌（即分批灭菌）将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间，在冷却到接种温度，这一工艺过程称为实罐灭菌，也叫间歇灭菌。

10、种子扩大培养 ：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。

11、初级代谢产物 是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的物质和能量的过程。这一过程的产物即为初级代谢产物。

12、倒种 ：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 P 147

13、维持消耗（m） 指维持细胞最低活性所需消耗的能量，一般来讲，单位重量的细胞在单位时间内用于维持消耗所需的基质的量是一个常数。

14、产物促进剂 是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂

15、补料分批培养 ：在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。

16、发酵热 ：所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。什么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。

17、染菌率 总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内

18、连续培养 ： 发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。 达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。

19、临界溶氧浓度 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度 20、回复突变 由突变型回到野生型的基因突变 21、种子 见种子扩大培养

22、培养基 广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。

23、发酵工程：利用微生物特定性状和功能，通过现代化工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系，是将传统发酵于现代的DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术集合并发展起来的发酵技术。 二、填空题

1、 微生物发酵培养（过程）方法主要有 分批 培养、补料分批 培养、连续 培养、半连续 培养四种。 2、 微生物生长一般可以分为：调整期、对数期、稳定期和衰亡期。 3、 发酵过程工艺控制的只要化学参数 溶解氧、PH、核酸量等 . 4、 发酵过程控制的目的就是得到最大的比生产率和最大的得率。 5、 菌种分离的一般过程 采样、富集、分离、目的菌的筛选。 6、 富集培养目的就是让 目的菌 在种群中占优势，使筛选变得可能。

7、 根据工业微生物对氧气的需求不同，培养法可分为 好氧培养 和 厌氧培养 两种。 8、 微生物的培养基根据生产用途只要分为 孢子 培养基、种子 培养基和发酵培养基。

9、 常用灭菌方法：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌

10、 常用工业微生物可分为： 细菌、 酵母菌、 霉菌、 放线菌四大类。

11、 发酵过程工艺控制的代谢参数中物理参数 温度、压力、搅拌转速、功率输入、流加数率和质量 等 12、 环境无菌的检测方法有：显微镜检查法、肉汤培养法、平板培养法、发酵过程的异常观察法等 13、 染菌原因： 发酵工艺流程中的各环节漏洞和发酵过程管理不善两个方面。

14、 实验室中进行的发酵菌液体发酵方式主要有四种：试管液体培养、浅层液体培养、摇瓶培养、台式发酵罐 15、 发酵高产菌种选育方法包括 （自然选育）、（杂交育种）、（诱变育种）、（基因工程育种）、（原生质体融合）。 16、 发酵产物整个分离提取路线可分为：预处理、固液分离、初步纯化、精细纯化和成品加工加工等五个主要过程。 17、 发酵过程主要分析项目如下 ：pH、排气氧、排气CO2和呼吸熵、糖含量、氨基氮和氨氮、磷含量、菌浓度和菌形态。 18、 微生物调节其代谢采用 酶活性、酶合成量、细胞膜的透性。

19、 工业微生物菌种可以来自 自然分离，也可以来自从微生物 菌种保藏机构 单位获取。 20、 发酵工业上常用的糖类主要有 葡萄糖、糖蜜。

21、 工业发酵方式根据所用菌种是单一或是多种可以分为 单一纯种 发酵和 混合 发酵。

22、 种子及发酵液进行无菌状况控制常用的方法 显微镜检测法、酚红肉汤培养基法、平板画线培养法、发酵过程的异常观察法。 23、 菌种的分离和筛选一般分为 采样、富集、分离、目的菌的筛选步骤。 24、 菌种的分离和筛选一般可分为＿＿＿＿＿＿＿＿。

25、 常用灭菌方法有：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌 三、问答题

1、发酵工程的概念是什么？发酵工程基本可分为那两个大部分，包括哪些内容

答：发酵工程是利用微生物特定性状好功能，通过现代化工程技术生产有用物质或其直接应用于工业化生产的技术体系，是将传统发酵与现代的DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的发酵技术。也可以说是渗透有工程学的微生物学，是发酵技术工程化的发展，由于主要利用的是微生物发酵过程来生产产品，因此也称为微生物工程。 ?

一.发酵部分: 1.菌种的特征和选育 ? 2.培养基的特性，选择及其灭菌理论 ? 3．发酵液的特性 ? 4.发酵机理。 ? 5.发酵过程动力学 ? 6.空气中悬浮细菌微粒的过滤机理 ? 7.氧的传递。溶解。吸收。理论。 ? 8.连续培养和连续发酵的控制 ?

二.提纯部分 ? 1.细胞破碎，分离 ? 2.液输送，过滤. 除杂 ? 3.离子交换渗析，逆渗透，超滤 ? 4.凝胶过滤，沉淀分离 ? 5溶媒萃取，蒸发蒸馏结晶，干燥，包装等过程和单元操作 2、现代发酵工程所用的发酵罐应具备那些特征？

答：（1）、发酵罐应有适宜的径高比。罐身较长，氧的利用率较高； （2）、发酵罐应能承受一定的压力。因为发酵罐在灭菌和正常工作时，要承受一定的压力（气压和液压）和温度； （3）、发酵罐的搅拌通风装置能使气液充分混合，实现传质传热作用，保证微生物发酵过程中所需的溶解氧； （4）、发酵罐内应尽量减少死角，避免藏污纳垢，保证灭菌彻底，防止染菌； （5）、发酵罐应具有足够的冷却面积； （6）、搅拌器的轴封要严密，以减少泄露。

3、微生物发酵的种子应具备那几方面条件？

答:（1）、菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短。 （2）、生理性状稳定。 （3）、菌体总量及浓度能满足大量发酵罐的要就。 （4）、无杂菌污染。 （5）、保持稳定的生产能力。 4、发酵工业上常用的氮源有那些，起何作用？

答：氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。 1、无机氮源 种类：氨盐、硝酸盐和氨水 特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如： (NH4)2SO4 → 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH 无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。 所以选择合适的无机氮源有两层意义： 满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的pH

2、有机氮源 来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。 成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。 有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响

5、发酵产品的生产特点是什么，什么是种子扩大培养，其任务是什么？

答： （2）、种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 （3）、种子扩大培养的任务： 现代的发酵工业生产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十立方米甚至几百立方米，?要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。

（1）发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化学反应。 其主要特点如下：

1，发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。

2，发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这—特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。 3，发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单—的代谢产物。

4，由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。

5，发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。除了必须对设备进行严格消毒处理和空气过滤外，反应必须在无菌条件下进行。如果污染了杂菌，生产上就要遭到巨大的经济损失，要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。因而维持无菌条件是发酵成败的关键。 6，微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。

7，工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快，开可以取得显着的经济效益。 基于以上特点，工业发酵日益引起人们重视。和传统的发酵工艺相比，现代发酵工程除了上述的发酵特征之外更有其优越性。除了使用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的“工程菌’来进行反应；反应设备也不只是常规的发酵罐，而是以各种各样的生物反应器而代之，自动化连续化程度高，使发酵水平在原有基础上有所提高和和创新。 发酵产品的生产特点： ①一般操作条件比较温和； ②以淀粉、糖蜜等为主，辅以少量有机、无机氮源为原料； ③过程反应以生命体的自动调节方式进行； ④能合成复杂的化合物如酶、光学活性体等； ⑤能进行一些特殊反应，如官能团导入； ⑥生产产品的生物体本身也是产物，含有多种物质； ⑦生产过程中，需要防止杂菌污染； ⑧菌种性能被改变，从而获得新的反应性能或提高生产率。

6、培养成分用量的确定有什么规律？

答： （1）、参照微生物细胞内元素的比例确定。培养基的成分配比虽然千差万别，但都是用来培养某种微生物的，而不同类型的微生物细胞的成分比例其实是有一定规律的。这些规律可以在很大程度上知道培养基的基本成分配比的选择。 不同种类的微生物内某种成分的含量其实是比较稳定的。培养基最终会被微生物吸收利用，因此其成分比例可以参考该种微生物的成分比例，至少可以作为一个重要依据。另外，尽管不同种类的微生物的成分比例有一定的差异，但还是有一定共性的。所以培养基中这集中营养成分不管由什么具体物质提供，其用量基本上也符合这种关系。

（2）参照碳氮比确定。如果培养基中碳源过多，不利产物的合成。同样碳源过少或氮源过少对发酵的影响也是不利的。不同种微生物碳氮比差异很大，既是同种微生物在其不同生理时期对碳氮比要求也有不同，所以最适碳氮比要通过试验确定，一般在100：（1—20）之间。 （3）、其他因素。培养基中一些用量极少的物质一般要严格控制，不能过量。例如，维生素、微量元素、某些生长因子、前体等。具体用量要通过试验确定。培养基中的一些成分的比例会影响培养基的某些理化性质，这时要引起重视。 7、叙述防止发酵菌种退化的具体条件措施有那些？ 答：

（1）控制传代次数：尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少细胞分裂过程中所产生的自发突变几率。 （2）创造良好的培养条件：如在赤霉素生产菌G.fujikuroi的培养基中，加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5‘-核苷酸或甘露醇等丰富营养物时，有防止衰退效果。

（3）利用不易衰退的细胞传代：对于放线菌和霉菌，菌丝细胞常含有几个细胞核，因此用菌丝接种就易出现衰退，而孢子一般是单核的，用于接种就可避免这种现象。 （4）采用有效的菌种保藏方法

（5）合理的育种：选育菌种是所处理的细胞应使用单核的，避免使用多核细胞;合理选择诱变剂种类或增加突变位点，以减少分离回复突变；在诱变处理后及分离提纯化，从而保证保藏菌种的纯度。

（6）、选用合适的培养基 在培养基中添加某种化学物质可以防止菌种退化。或者选取营养相对贫乏的培养基在菌种保藏培养基，限制菌株的生长代谢减少变异反而发生从而防止菌种的退化。 8、如何选择最适发酵温度？

答：1、根据菌种及生长阶段选择。 微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。

2、根据培养条件选择。 温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。 通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。 培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。

3、根据菌生长情况 菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最

适温度。

9、不同时间染菌对发酵有什么影响，染菌如何控制？

答：（1）种子培养期染菌：由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。 如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。

（2）发酵前期染菌：发酵前期最易染菌，且危害最大。 原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。 在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。

染菌措施 可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。

（3）发酵中期染菌 ：发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。

措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。

（4） 发酵后期染菌：发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。

发酵染菌后的措施： 染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。 ? 凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。 ? 染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒 10、发酵级数确定的依据是什么？

答： 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数 谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵 青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵 1、发酵级数确定的依据：级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。 2、级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。 3、 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面 11、发挥菌种的最大生产潜力主要考虑那几点？ 12、什么是半连续培养，说明其优缺点。

答：在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。某些品种采取这种方式，如四环素发酵 优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。 缺点 代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大 13、发酵工程主题微生物有什么特点？

答：发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌 特点：(1)对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力 (2)有极强的消化能力 (3)有极强的繁殖能力 14、什么叫染菌，对发酵有什么影响，对提炼有什么危害？

答：染菌：发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖 染菌的影响：发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤。 ? 造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失 ? 扰乱生产秩序，破坏生产计划。 ? 遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。 ? 影响产品外观及内在质量 发酵染菌对提炼的影响：染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯

15、结合所学《微生物发酵工程》课程论述某个工业发酵产品的生产工艺流程（可画图说明），越详细越好。 答：①培养基制备 ②、无菌空气制备 ③、菌种与种子扩大培养 ④、发酵培养 ⑤、通过化学工程技术分离、提取、精制。

发酵工程

一、名词解释

1、分批发酵：在发酵中，营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排出外，与外部没有物料交换。 2、 补料分批发酵：又称半连续发酵，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统不加一定物料的培养技术。 3、絮凝：在某些高分子絮凝剂的作用下，溶液中的较小胶粒聚合形成较大絮凝团的过程。 二、填空

1、 生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种制备、种子培养、发酵和提取精制等下游处理几个过程。 2、 微生物的育种方法主要有三类：诱变法，细胞融合法，基因工程法。 3、 发酵培养基主要由碳源，氮源，无机盐，生长因子组成。

5、青霉素发酵生产中，发酵后的处理包括：过滤、提炼，脱色，结晶。

6、利用专门的灭菌设备进行连续灭菌称为连消，用高压蒸汽进行空罐灭菌称为空消。 7、可用于生产酶的微生物有细菌、真菌、酵母菌。 常用的发酵液的预处理方法有酸化、加热、加絮凝剂。

8、根据搅拌方式的不同，好氧发酵设备可分为机械搅拌式发酵罐和通风搅拌式发酵罐两种。 9、依据培养基在生产中的用途，可将其分成孢子培养基、种子培养基、发酵培养基三种。

10、现代发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵生产，还包括微生物机能的利用。

11、发酵工程的主要内容包括生产菌种的选育、发酵条件的优化与控制、反应器的设计及产物的分离、提取与精制。 12、发酵类型有微生物菌体的发酵、微生物酶的发酵、微生物代谢产物的发酵、微生物转化发酵、生物工程细胞的发酵。 13、发酵工业生产上常用的微生物主要有细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。

14、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，从自然选育转向代谢调控育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 15、根据操作方式的不同，液体深层发酵主要有分批发酵、连续发酵、补料分批发酵。

16、分批发酵全过程包括空罐灭菌、加入灭过菌的培养基、接种、发酵过程、放罐和洗罐，所需的时间总和为一个发酵周期。 17、分批发酵中微生物处于限制性的条件下生长，其生长周期分为延滞期、对数生长期、稳定期、衰亡期。 18、根据搅拌的方式不同，好氧发酵设备又可分为机械搅拌式发酵罐、通风搅拌式发酵罐。

19、下流加工过程由许多化工单元操作组成，通常可以分为发酵液预处理和固液分离、提取、精制及成品加工四个阶段。

20、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌 ，从自然选育转向代谢调控育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 21、微生物发酵产酶步骤为先选择合适的产酶菌株、后采用适当的培养基和培养方式进行发酵、微生物发酵产酶、酶的分离纯化、制成酶制剂。 四．简答

1、工业上常用的菌种保藏方法？ ①斜面冰箱保藏法； ②沙土管保藏法； ③石蜡油封保藏法； ④真空干燥冷冻保藏法； ⑤液氮超低温保藏法

2、发酵培养基由哪些成份组成？

（1）碳源 构成菌体和产物的碳架及能量来源

（2）氮源 构成微生物细胞物质或代谢产物中氮素来源的营养物质 （3）无机盐和微量元素 （4）生长因子

（5）水、产物形成的诱导物、前体和促进剂 3、根据操作方式的不同，发酵类型主要分成哪几种？ （1）分批发酵 （2）连续发酵 （3）补料分批发酵 （4）固体发酵 4、简述发酵工程的类型

（1）微生物菌体发酵：以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。

（2）微生物酶发酵：微生物具有种类多、产酶品种多、生产容易和成本低等特点。 （3）微生物代谢产物发酵：初级代谢产物、次级代谢产物。

（4）微生物的转化发酵微生物转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。 （5）生物工程细胞的发酵：这是指利用生物工程技术所获得的细胞，如DNA重组的“工程菌”以及细胞融合所得的“杂交”细胞等进行培养的新型发酵，其产物多种多样。 5、简述发酵技术特点

①发酵过程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应过程能够在发酵设备中一次完成； ②在常温常压下进行，条件温和，能耗少，设备较简单；

③原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品、工业废水或可再生资源，微生物本身能有选择地摄取所需物质； ④容易生产复杂的高分子化合物，能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入或去除等反应； ⑤发酵过程中需要防止杂菌污染，大多情况下设备需要进行严格的冲洗、灭菌，空气需要过滤等。 五、论述

1.论述液体深层发酵有哪些优点？发酵方式分为几类？

优点：

①是很多微生物的最适生长环境；

②菌体及营养物、产物易于扩散，使在均质或拟均质条件下进行，便于控制，易于扩大生产规模； ③液体输送方便，易于机械化操作；

④厂房面积小，生产效率高，易自动化控制，产品质量稳定； ⑤产品易于提取、精制等。 方式：

（1）分批发酵 ：营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放罐，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。

（2）连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。可以有效地延长分批培养中的对数期。

（3）补料分批发酵又称半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。 可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证微生物的生长需要，又不造成不利影响，从而达到提高产率的目的。 2、论述发酵下游加工过程 （1）预处理方法：

加热：适当加热之后，发酵液中的蛋白由于变性而凝聚，形成较大的颗粒，发酵液的粘度就会降低。此法仅适用于对非热敏感性产品发酵液的预处理。

调节PH值：适当的PH值可以提高产物的稳定性，减少其在随后的分离纯化过程中的损失。此外，发酵液PH值的改变会影响发酵液中某些成分的电离程度，从而降低发酵液的粘度。注意选择比较温和的酸和碱，以防止局部过酸或过碱。草酸较常用。

加入絮凝剂：通常情况下，细菌的表面都带有负电荷，可以在发酵液中加入带正电荷的絮凝剂，从而使菌体细胞与絮凝剂结合形成絮状沉淀，降低发酵液的上粘度，利于菌体的收获。

（2）固液分离方法：常用到过滤、离心等方法。如果欲提取的产物存在于细胞内，还需先对细胞进行破碎。沉淀提取法、色谱分离法、萃取法、膜分离技术

（3）精制：初步纯化中的某些操作，如沉淀、超滤等也可应用于精制。大分子(蛋白质)精制依赖于层析分离，小分子物质的精制则可利用结晶操作

（4）成品加工：经提取和精制后，根据产品应用要求，有时还需要浓缩、无菌过滤和去热原、干燥、加稳定剂等加工步骤。 一、填空（20分，每空1分）

1.生长因子如氨基酸和核苷酸产生菌的分离用随机分离方法初筛，其 方法主要是通过观察分离菌能否促进 的生长，来检出生长因子产生菌。 2.紫外线的作用机制主要是形成 以改变DNA生物活性， 造成菌体变异甚至死亡。

3.目前常用的获得目的基因的方法有 、 和 。

4.末端产物（终产物）阻遏方式普遍存在于 、 生物合成途径中。 5.按照操纵子模型理论， 、 和 构成 操纵子。 6.在酵母Ⅱ发酵液中添加 ，发酵的终产物是 。 7.通过前体单体聚合的次级代谢物有 、 和 等抗生素。 8.抗生素生物合成中的所有甲基化作用均以 作为甲基供体。 9.Monod方程的表达式为 ，它描述的是微生物生长和 之间的关系。 10.只含有单一液相，且粘度小的典型溶液属于 流体；含有 固相、气相和液相而且粘度较大的发酵醪属于 流体。 三、名词解释（共16分，每题4分）

1. 营养缺陷型 2. 酵母Ⅱ型发酵 3. 前体 4. 比生长速率（μ） 四、简答题（共24分，每题6分） 1. 分析工程菌质粒不稳定现象的原因？ 2. 有哪两种类型操纵子？请说明其调节机制？

3.易利用的基质如葡萄糖会产生代谢物阻遏，试阐明葡萄糖阻遏的作用机制？ 4. 种子培养基、发酵培养基、补料培养基的组成特点及其如何衔接？ 五、论述题（共20分）

1.有一培养基如下 : 甘露醇，MgSO4，K2HPO4，KH2PO4，CuSO4， NaCl，CaCO3，蒸馏水。试述该培养基的：A.碳素来源;B.氮素来源;C.矿质来源，该培养基可用于培养哪类微生物(8分)

2.为什么说在谷氨酸的合成中，糖的分解代谢途径与CO2固定的适当 比例是提高收率的关键？（12分） 一、填空（20分，每空1分）

1.营养缺陷型 2.胸腺嘧啶二聚体 3.鸟枪法 cDNA法 人工合成 4.氨基酸 核苷酸 5.操纵基因 启动基因 结构基因 6.亚硫酸氢钠 甘油 7.四环类 大环内酯类 安莎霉素类 8.甲硫氨酸 9. 限制型基质 10.牛顿型 非牛顿型 三、 1. 营养缺陷型 是指丧失了合成某种营养物质的能力，在培养基中若不外加这种 营养成分就不能正常生长的变异菌株。营养缺陷型菌株不仅用于生 产，在分子育种工作中常用作选择性标记。

2. 酵母Ⅱ型发酵 是指酵母在有亚硫酸氢钠存在的情况下，亚硫酸氢钠和乙醛结合成复合物，致使乙醛不能作为受氢体，而迫使磷酸二羟丙酮代替乙醛作为受氢体，生成α-磷酸甘油。α-磷酸甘油在α-磷酸甘油磷酸酯酶的催化下水解，除去磷酸，生成甘油。

3. 前体 是指加入到发酵培养基中的某些化合物能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。

4. 比生长速率 在微生物分批培养的对数生长阶段，菌体的生长不受限制，菌体浓度随培养时间呈指数增长，菌体浓度的变化率与菌体浓度成正比，即dX/dt=μX。μ称为比生长速率，反映的是单位体积的菌量（干重）在单位培养时间内所收获的菌量（干重）。 四、 1. 分析工程菌质粒不稳定产生的原因？

答：工程菌质粒不稳定可分为分裂不稳定和结构不稳定两种情况。质粒分裂不稳定是指工程菌分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌。质粒结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失，引起工程菌性能的改变。 质粒不稳定常见的是分裂不稳定，主要与两个因素有关：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，主要发生在含低拷贝数的工程菌中；二是含质粒菌和不含质粒菌的比生长速率差异的大小。主要发生在含高拷贝数的工程菌中，因外源质粒大量的产生而造成这种差异，所以一旦产生不含质粒菌，则能较快地取代质粒菌成为优势菌。

2. 有哪两种类型操纵子？请说明其调节机制？

答：一类是诱导型操纵子，只有当存在诱导物（一种效应物）时，其转录频率才最高，并随之转译出大量诱导酶，出现诱导现象。 另一类是阻遏型操纵子，只有当缺乏辅阻遏物（一种效应物）时，其转录频率才最高。由阻遏型操纵子所编码的酶的合成，只有通过去辅阻遏物阻遏作用才能起动。

3. 易利用的基质如葡萄糖会产生分解代谢物阻遏，试阐明葡萄糖阻遏的作用机制？

答：首先，葡萄糖的大量存在，降低了胞内 cAMP 浓度，其影响机制有以下两方面： 一方面，葡萄糖抑制腺苷酸环化酶活性，降低ATP生成 cAMP ，见下式： ATP → cAMP + Pii

另一方面，葡萄糖存在消耗胞内cAMP，引起ATP浓度上升，见下式： cAMP + H2O → ADP → ATP

其次，在操纵子的启动子上有两个结合位点，一个与cAMP－CAP（cAMP受体蛋白）复合物结合，另一个与RNA聚合酶结合；cAMP－CAP复合物能促进RNA聚合酶的结合和转录（活化），由于cAMP 浓度的降低，该复合物不能形成，使得RNA聚合酶也无法结合到启动子的位点上，结构基因不能转录和表达。

4. 种子培养基、发酵培养基、补料培养基的组成特点及其如何衔接？ 答：种子培养基用于供孢子发芽、生长和大量繁殖粗壮，活力强的菌丝体。

这类培养基的碳源应提供速效碳源，如葡萄糖等；氮源则提供易于利用的，如无机氮源（NH4）SO4，有机氮源如玉米浆、酵母膏、蛋白胨等；磷酸盐浓度适当高一些；但总浓度以略稀薄为好，可获得较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。最后一级种子培养基的成分尽可能接近发酵培养基，使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。 发酵培养基既要有利于生长繁殖，防止菌体过早衰老，又要有利于产物大量合成。因此，发酵培养基的组成应丰富、完全，碳、氮源要注意速效和迟效的搭配，少用速效营养，多加迟效营养；还要考虑适当的碳氮比，加缓冲剂稳定pH；还要有菌体生长所需的生长因子和产物合成所需的元素、前体和促进剂等。

补料培养基主要是针对以下两种情况：一是发酵培养基基础料浓度过高导致培养基过于粘滞，致使搅拌动力消耗增加，消泡困难，溶解氧下降，渗透压过高等，以致不利于细胞的生长；二是生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同。则只能采用在不同时间区段培养基分批补料来加以满足，一般初始培养基称为基础料，在整个培养基配比中所占比例较小。 补料培养基在成分上可与初始发酵培养基完全相同，也可根据需要进行较大调整。

五、 1. 答：甘露醇是一糖醇，为该培养基的碳素来源；MgSO4，K2HPO4，KH2PO4，CuSO4， NaCl，CaC03则是矿质来源。磷是核酸和蛋白质及细胞膜的必要成分，也是许多辅酶的组成元素，高能磷酸键在能量的储存和传递中有重要作用；镁在离子状态是 许多重要酶的激活剂；硫存在于细胞蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分和某些辅酶的活性基，如辅酶A；氯离子对嗜盐菌是需要的，钠离子维持细胞渗透压；钾离子除维持细胞渗透压和透性，还是许多酶的激活剂，促进糖代谢；钙离子能影响细胞膜的透性，还能影响培养基中磷酸盐的浓度；铜是微量元素作为酶的辅基和激活剂。 水是所有培养后的主要组成成分，也是微生物机体的重要组成成分，为微生物的生长繁殖和产物合成提供了必需的生理环境。

上述培养基中缺少氮源，可用来富集和培养能自主固氮的微生物，即自养固氮菌。

2. 答：谷氨酸的合成途径如下：葡萄糖由酵解途径（EMP途径）和单磷酸己糖途径（HMP途径）代谢生成两分子丙酮酸，其中一分子丙酮

酸固定CO2生成草酰乙酸，另一分子丙酮酸脱羧生成乙酰辅酶A，两者缩合成柠檬酸。柠檬酸进入三羧酸循环（TCA环）得到α-酮戊二酸。由于α-酮戊二酸继续进行的氧化代谢途径停滞，以及异柠檬酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶的有效配合，使α-酮戊二酸还原氨化作用高效率地进行，进而生成谷氨酸。 在上述过程中，丙酮酸固定CO2生成草酰乙酸和丙酮酸脱羧生成乙酰辅酶A应保持适当比例，才能保证谷氨酸的高收率。若丙酮酸固定CO2反应充分进行时，由葡萄糖生成谷氨酸的收率82%；若完全不发生CO2的固定，则丙酮酸全部氧化脱羧生成乙酰辅酶A，经由乙醛酸环进行代谢。形成的异柠檬酸在异柠檬酸分解酶作用下分解为乙醛酸和琥珀酸，减少了α-酮戊二酸的生成量，谷氨酸的收率最多只有54%。 所以糖的分解代谢途径（EMP，HMP，TCA）与CO2固定的适当比例是提高谷氨酸收率的关键。