细胞培养实验

细胞培养实验

1：实验用品

（1）仪器：超净工作台，高压灭菌锅，电热干燥箱，滤器，酸缸，CO2培养箱，倒置显微镜，酶标仪，液氮罐，紫外灯。

（2）耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管

（3）试剂和药品：平衡盐溶液PBS，RPMI-1640培养基，胎牛血清，双抗（抗青霉素和抗链霉素），0.25％ 的胰酶，冻存液，DMSO。

溶液的配制：PBS: 5.8 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4

PH=7.4的PBS液的配制：称取Nacl 20g，Kcl 0.5g，Na2HPO4-12H2O 8.725g / Na2HPO4 5.8 g，KH2PO4 0.5g，加三蒸水2500ml，溶解，过滤，121℃灭菌20min，冷藏（4℃）备用。

0.25％ 的胰酶的配制：0.25g胰酶加100mlPBS溶液，冰浴中缓慢搅拌使完全溶解，过膜过滤器（0.22膜过滤器）除菌，冷藏（4℃）备用。

培养基的配制：RPMI-1640培养基原液450ml+胎牛血清50ml+双抗（抗青霉素和抗链霉素）5ml，冷藏（4℃）备用。

冻存液的配制：RPMI-1640培养基原液30ml+胎牛血清6ml+ DMSO 4ml，冷藏（4℃）备用。

2：培养用品的清洗和消毒杀菌

2.1：培养用品的清洗

2.1.1：玻璃器皿的清洗

包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤

浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。

新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。

再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉。用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。

刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。

浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中，清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸

泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时。一般为24小时。

清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）

– 强清洁液 63∶1000∶200

次强清洗液 125∶ 200∶1000

弱清洁液 100∶ 100∶1000

配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分；配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。

本实验用次强酸：重铬酸钾125g+浓硫酸250ml+蒸馏水1000ml为一份，配制八份放入酸缸中，备用。

冲洗：在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹。

最好用洗涤装置，如用手工操作：

需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 次，晾干备用。

2.1.2：胶塞的清洗

新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理。

常规清洗方法：

每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），蒸馏水煮10分钟或者10%Hcl半个小时，然后自来水冲洗干净，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用。

2.1.3：塑料制品的清洗

塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。

必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。

2.2消毒：

细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染。

2.2.1常见原因：

a 操作间或周围空间的不洁。

b 培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底。

由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格

遵守操作常规，防止发生污染。

2.2.2消毒灭菌方法：

物理消毒灭菌法：

紫外线：用于空气，超净工作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min。

湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min。一般培养瓶，离心管，冻存管，枪头，PBS液等等都是湿热法。

过滤：0.22μm微孔膜过滤器。

化学消毒灭菌法：

75%酒精：主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。

1‰新洁尔灭：主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。

抗生素：主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。

3：细胞培养

3.1细胞种类：

MCF-7细胞（乳腺癌细胞），Hela细胞（宫颈癌细胞），HepG2细胞（肝癌细胞）都

为贴壁细胞。

3.2细胞计数

原理：

当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

操作：

1.盖好盖玻片：取血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。

2.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

3.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，分别数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中死细胞和活细胞数。

4.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：

（细胞悬液的细胞数）/ml＝ （ 四个大格子细胞数/4) ×2×104

说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。 公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：

1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3

3.3：MCF-7细胞的传代

原理：

体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。

操作：

(1)：将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液。

(2)：加入少许消化液即胰酶(以液面盖住细胞为宜)，静置1分钟左右，在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉。注意消化时间的控制，不能过长也不能过短。

(3)：加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。将细胞悬液移入离心管，1000r/min，离心5分钟，弃去上清液，再加入3ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液，用细胞计数板进行计数。

(4)：将细胞悬液吸出加到两个新的培养瓶中，每个瓶中加上1～2ml（加入量由细胞

浓度来定），并向每瓶中分别加10ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养

一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。

3.4细胞冻存

原理：

冻存细胞时要缓慢冷冻。因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。如：细胞脱水使局部电解质浓度增高，PH改变，部分蛋白质由于上述因素而变性；细胞核内DNA也是冷冻时细胞易受损伤的部分。。

冻存时要尽可能的均匀地减少细胞内的水分，减少细胞内的冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂

标准程序：

当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min

当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min

当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中

简易程序：

常温一个小时，4℃一个小时，-20℃一个小时，然后将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，液氮上层的液氮气中10个小时，最后放入液氮中长期保存。

操作：

1：用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心1000r/min，5min。

2：去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存液，冻存液中细胞的最终密度为（1～5）×106个/ml 。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入冻存管中，每只冻存管加液1～1.5ml。

3：冻存管必须旋紧确保封闭。冻存管上应写明细胞的名称、冻存时间等信息。

4：封存好的冻存管即可直接冻存。常温一个小时，4℃一个小时，-20℃一个小时，然后将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，液氮上层的液氮气中10个小时，最后放入液氮中长期保存。

3.5细胞的复苏

原理：复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。

用品：

操作步骤：

（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。冻存管投入温水后应立即把盖子扣上，以防发生意外。

（2）取出冻存管，用乙醇消毒后开启，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加10倍以上培养液，混合后1000r/min，离心5min 。

（3）去上清，加新鲜培养液适当稀释，接种培养瓶，放入CO2培养箱静置培养。细胞复苏时细胞术可以做10～20倍稀释，接种细胞密度以5×105个/ml为宜。