一、新的玻璃器皿的洗消：
1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。
6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。
7.高压消毒后烘干
二、旧的玻璃器皿的洗消：
1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔
溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。
2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。
3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）
5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。
金属器械洗消：
金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。
橡胶和塑料：
橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：
1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。
2. 胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
4. 胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。
5.塑料培养瓶，培养板，冻存管：
6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。
为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻
(CoC12?6H2o)2g，30％盐酸10m1，蒸馏水88m1。
注意事项：
1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。
2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。
3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。
PCR实验操作程序
1. 在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：
2. 反应物 加样顺序 体积(μl) 终浓度
3. 去离子水 1 29.4
4. 10×Buffer B 2 5 1×
5. 4×dNTP混合物 3 5 各200μmol/L
6. MgCl24 3 1.5mmol/L
7. 有义引物 5 2.6 0.25μmol/L
8. 反义引物 6 2.6 0.25μmol/L
9. 模板 7 2 0.1μg
10. TaqDNA聚合酶 8 0.4 1unit
11. 2. 用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50μl矿物油。每加一管换一次Tip。
12. 3. 振荡每只管，然后短暂离心。
13. 4. 将管放到预热的热循环中，按下列程序开始循环：
14. 预变性 94℃ 4分钟 1次
15. 变性 94℃ 1分钟
16. 退火 37-65℃ 1分钟
17. 延伸 72℃ 1分钟
18. 循环30次
19. 终延伸 72℃ 7分钟 1次
20. 保存 4℃
21. 5. 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果。电泳条件：60-80V,15-20分钟。
22. 6. 紫外分析仪检查电泳结果。
23. 四、讨论
24. 1.假阴性，不出现扩增条带
25. PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
26. 模板：①模板中含有Taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。③模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。
27. 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
28. 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，
而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
29. Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
30. 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
31. 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
32. 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
33. 2.假阳性
34. 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
35. 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR
扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
36. 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
37. 3.出现非特异性扩增带
38. PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
39. 4.出现片状拖带或涂抹带
40. PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策
有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。
PCR及RT-PCR之基础问题解答
1. 问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因：
1）RNA被降解
建议解决方法：
在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；
在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；
如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。
2）RNA中包含逆转录抑制剂
建议解决方法：
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
3）多糖同RNA共沉淀
建议解决方法：
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
建议解决方法：
确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体.
确定GSP是反义序列。
5）起始RNA量不够
建议解决方法：
增加RNA量。
对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
6）RNA模板二级结构太多
建议解决方法：
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.
提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。
注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
7）引物或模板对残余的RNA模板敏感
建议解决方法：
在PCR前用RNaseH处理。
8）靶序列在分析的组织中不表达
建议解决方法：
尝试其他靶序列或组织
9）PCR没有起作用
建议解决方法：
对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。
2.问题：PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因：
1）PCR引物设计较差
建议解决方法：
避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
2）DNA含有抑制剂
建议解决方法：
诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA。
3）富含GC的模板
建议解决方法：
对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。
4）模板浓度太低
建议解决方法：
使用104拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
5）镁离子浓度太低
建议解决方法：
从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。
6＝退火温度太高
建议解决方法：
使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
7＝引物浓度太低
建议解决方法：
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。
3.问题：RT-PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。
可能原因：
1＝物和模板非特异性退火
建议解决方法：
在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。
试用允许高温cDNA合成的GSP。
2＝GSP设计较差
建议解决方法：
遵循用于扩增引物设计的同样原则
3＝RNA中沾染了基因组DNA
建议解决方法：
使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
4.问题：PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。
可能原因：
1＝形成引物二聚体
建议解决方法：
设计在3'端没有互补序列的引物。
2＝引物和模板非特异性退火
建议解决方法：
以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。
在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。
使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。
避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
3＝镁离子浓度太高
建议解决方法：
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
4＝因为扩增复杂模板导致引物错误起始
建议解决方法：
使用巢式PCR或递减PCR。
5＝沾染外源DNA
建议解决方法：
使用抗气雾剂的tip和UDG。
6＝因为二级结构导致引物结合位点无法接近
建议解决方法：
对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCRx Enhancer Solution。
5.问题：PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误
可能原因：
1＝聚合酶忠实性低
建议解决方法：
使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。
2＝循环数太多
建议解决方法：
降低循环数。
3＝四种dNTP的浓度不同
建议解决方法：
制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。
从RNA抽提到电泳鉴定
RNA抽提
一，准备工作
1， 实验器具与材料：
（1） 移液枪：1ml、200ul、10ul
（2） 吸头：1ml、200ul、20ul
（3） 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个
（4） EP管1.5ml、100ul
（5） 玻璃研磨器
（6） 容量瓶：1000ml
（7） 盐水瓶：100ml
（8） 15ml塑料管一个（配75％乙醇用）
2， 实验器具的处理与准备
（1） 塑料制品：（包括吸头、EP管等）
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。
（2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）
先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。
（3） 金属制品：（镊子等）
先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）
3， 试剂配制和准备：
（1） DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。
（2） 75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。
（3） 异丙醇：放入棕色瓶
（4） 氯仿：放入棕色瓶
（5） Trizol：100ml/瓶 存放于4℃
二，抽提时注意事项：
全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
三，抽提步骤
1．匀浆化作用
取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。
2．分离阶段
每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。
3．RNA的沉淀
将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。
4．RNA的洗脱
小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。
5．RNA的再溶解
小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。
6，RNA的保存
提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。
TRIzol法抽提总RNA细胞
组织100mg 1×107
↓
加1mlTRIzol
↓细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
匀浆（要彻底，后转至EP管）
（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）
↓
颠倒混匀15S，室温5分钟
↓
4℃，离心12000rmp，15分钟
↓
转上层水相（约400-500μl）于另一新1.5mlEP管中
↓
加等体积异丙醇（约400 -500μl），混匀后-20℃中1小时
↓
4℃，离心12000rmp，10分钟
↓
弃上清
↓
加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml
↓
4℃离心7500rmp，5分钟
↓
弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能完全干燥）
↓
溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，<10分钟助溶）
↓
立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录
逆转录（RT）
一，准备工作
1， 实验器具与材料：
（1）移液枪：200ul、10ul
（2）吸头：200ul、20ul
（3）EP管1.5ml、100ul
（4）水浴箱
2，实验器具的处理与准备
塑料制品：（包括吸头、EP管等）
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。
3，试剂配制和准备：
（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。
（2）RT中所需要的各种试剂
（3）引物浓度计算方法： （新合成的引物的稀释） 假如终浓度为X uM(pmol/ul) 加DEPC水体积（ul）＝（OD×33×1000000）/（分子量×X）
二，RT时注意事项：
为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。
三，RT步骤
用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积）
1， 准备0.65ml的EP管
2， 冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。
3， 65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。
4， 短暂离心后，冰上操作：加入4ul 5×First-Strand Buffer，1ul 0.1MDTT，1ul RNAse Inhibitor，1ul SSⅢ逆转录酶。
5， 短暂离心
6， 50℃水浴60分钟进行逆转录。
7， 70℃水浴15分钟灭活逆转录酶
8， -20℃保存，或立即进行PCR。
用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积）
1， 准备0.65mlEP管
2， 加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA
3， 稍离心，100℃沸水裕1min
4， 加入0.5uldNTP，2ul 5×Buffer，1ul AMV逆转录酶
5， 稍离心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT
6， 100℃沸水裕3min灭活AMV
7， 立即PCR或-20℃保存。
聚合酶链式反应（PCR）
二，准备工作
8， 实验器具与材料：
（1）移液枪：200ul、10ul
（2）吸头：200ul、20ul
（3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个
（4）EP管1.5ml、100ul
2，实验器具的处理与准备
(1) 塑料制品：（包括吸头、EP管等）
送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。
3, 试剂配制和准备：
(1) 双蒸水： 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。
(2) PCR中所需要的各种试剂
三，PCR时注意事项：
佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
四，PCR步骤
1， 准备100ul EP管
2， 依次在管中加入：（50ul反应体系）
ddH2O 37.5ul ×？
10mM dNTP 1ul ×？
10×PCR buffer 5ul ×？
25mM Mgcl2（加之前要摇匀） 3ul ×？
上游引物 1ul ×？
下游引物 1ul ×？
模板cDNA 1ul
3， 稍离心
4， 100℃沸水浴1分钟
5， 趁热加入Tag酶0.5ul（冰上操作）
6， 再加入50ul液体石蜡封闭
7， 10000rmp离心1分钟
8， PCR条件
94℃ 1min
58℃ 50sec
72℃ 1min30sec
进行40个循环，然后72℃ 10min 完后4℃保温。
9，10000rmp离心5min
10，将下层水相转入新的0.65mlEP管中，-20℃保存。
电泳鉴定
一，准备工作
1，实验器具与材料：
（1）移液枪：10ul
（2）吸头：20ul
（3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个
（4）三角烧瓶：50ml一个
（5）琼脂糖
2，实验器具的处理与准备
(1) 塑料制品：（包括吸头等）
送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。
（2）电泳板及电泳槽：
用自来水冲洗干净备用
3, 试剂配制和准备：
(1) 电泳缓冲液（TAE）：
先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液：将37.2g EDTA-Na加入160ml蒸馏水中，在搅拌器上剧烈搅拌。在用NaOH调节溶液PH值至8.0（约需4gNaOH）。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。
再配制50×TAE溶液：在400ml蒸馏水中溶解121g Tris碱，加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸馏水定容至500ml，室温保存。
（2）琼脂糖溶液（1.0％）：
50×TAE溶液取10ml，稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖，电炉上煮至沸腾，溶化的琼脂物冷却至60℃左右时加入10mg/ml EB 5ul，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置45min左右后进行电泳。
（3）溴化乙锭（EB）（10mg/ml）：
在20ml水中加入0.2g溴化乙锭，磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中，室温保存。
（4）加样缓冲液（Loading Buffer）一般为6×Loading Buffer
二，电泳鉴定时注意事项：
佩戴一次性手套，避免皮肤接触EB。无路做胶还是电泳缓冲液尽量用新的，不要超过两周。
三，电泳步骤
1， 50×TAE取10ml稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖。电炉上煮沸后加入EB 5ul。另外450ml TAE倒入电泳槽中。
9， 用透明胶封闭电泳板，琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电泳板中，冷却后，拔出梳子，放入电泳槽中。
10， 加样：PCR Marker：1ul Marker＋1ul Loading Buffer＋4ul TAE混匀于塑料膜上，加入孔中。PCR样品：5ul 样品DNA＋1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。
11， 接上电源，电压120V，电流50mA进行电泳。
12， 电泳约1小时后，紫外灯检测。
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