激光捕获显微切割细胞的全基因组DNA扩增

病理学杂志２ＯＯ２年２月第３ｌ卷第１　２００２．Ⅷ３１．№．１　低倍电子显傲镜下的观察结果相媲美。树脂包埋薄切片的　天青一美蓝染色还可对周围神经进行形态测量学研究，在观　察周围神经病理形态变化的同时还可对神经柬的面积及有　髓神经纤维的数量、直径甚至髓鞘的厚薄作计量研究，从而　为脱髓病变及轴索病变的诊断提供更为可靠的参考数据。　参ｌ郭玉璃．何毅，王建明考文献　遗传运动感觉性周围神经病　中华神经　精神科杂志，１９９２，２５　２６１－２６３　２郭玉璞，陈琳，曾维民线粒体肌病合并周围神经扁．中华神经　精神科杂志．１９９２，２５：２５８－２６０　３郭玉璞，王建明，何毅糖尿病周围神经病临床病理观察中华　病理学杂志，１９９１，２０，４：２９２－２９４　４袁云，陈清棠，吴丽娟．多发性肌炎的周围神经改变．中华神经　圈２　用自来水分色时髓鞘及神经轴索色泽偏蓝　天青一美蓝　染色｛葺ｘ　２Ｄ０　精神科杂志，１９９３，２６：３５．３７　５于洪藻。李成库病理标车村作技木长春：白求思医科大学出　版社，ｌ９８９　１５５—１５９．　丰富区域的皮肤活检，镜下可以找到感觉神经的末梢纤维成　分。　６田玉旺，邢惠清，丁华野，等．变色酿２Ｒ一亮绿法在神经髓鞘染色　中的应用中华病理学杂志．１９９８，２７：３０７　７邛平，宋一旋，祝隶镇．改良三色法显示石蜡切片中的神经轴究　我们舟绍的方法有　速简便、分辨清晰的特点，在病理　及神经髓鞘中华病理学杂志，１９９８　２７：２３５．　（收藕日期：２００１＂０１．１７）　诊断方面可以比石蜡切片提高分辨率，为明确诊断提供更详　细的信息　在光学显傲镜下显示很多微细的结构甚至可以与　（本文编辑：常秀青）　激光捕获显微切　细胞的全基因组ＤＮＡ扩增　王振宁马琳徐惠绵　姜莉　张成洪何向民　陈峻青　张学　种从徽量同质细胞中制备足够量基因组ＤＮＡ用于多次聚合　组织是多种细胞群体相互作用、相互依存的三维空间结　构，这使得在相当长的一段时间内难以准确、深＾地从分子　水平研究某类特定细胞基因结构和功能的动态变化。肿瘤　酶链反应（ＰＣＲ）检测的方法，以提高实验结果的可重复性、　可信性、可比性及后续工作的效率。　一组织包括瘤细胞、其发源的正常细胞、淋巴细胞、血管内皮细　胞、成纤维细胞等多种成分。在肿瘤分子病理学和基因组学　研究中，排除非肿瘤细胞污染对实验结果的影响尤为重　要…。激光捕获显微切割（１ａｓｅｒ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｎｉｆｃｒｏｄＪｓ唧　ｎ。ＬＣＭ）　是在显散镜下从组织切片中分离、纯化单一类型细胞群或单　个细胞的技术。２　Ｊ　它能有效地解除组织中细胞异质性造成　、材料和方法　１实验材料：人胃癌组织取自我校第一临床学院肿瘤外　科２０ＯＯ年３月手术标本。高可信度Ｐｙｌ＇￣ｅ　ＤＮＡ聚台酶　（５　ｕ／　）、１０×　ｌ０ｈ嘲ｔ缓冲液、ｄＮＴＰｓ以及普通Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合　酶【５　ｕ／　）、１０　Ｘ　ｐｃＲ缓冲液、ｄＨⅡ　购自宝生物工程（大连）　有限公司。￣－ｃａｔｅｎｉｎ基因外显子３　Ｉ：＇ＣＲ扩增弓ｌ物为：５　一　ＴＧＧＡＡＣＣＡ　的偏差。但从ＬＣＭ获得的有限细胞中提取的微量ＤＮＡ难以　满足多基因、多位点、多次检测的需求，特别是以ＤＮＡ芯片　ＴＡＴＣＣ－－３，扩增片段为１４９　ｂｐ；ＩＬ－１Ｂ基因启动子区域ＰＣＲ扩　增引物为５＇－ＡＧＡＡＧＣＴＩ￣ＣＡＣＣＡＡＴＡＣＴＣ．３　和５＇－ＡＣ，ＣＡＣＣ一　３　，扩增片段为２３９　ｂｐ；ｐ２１基因ＰＣＲ扩　增引物为５　．ＴＡＣＣＣｃｒｃＡＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧ３Ｗ＿Ｍ￣ＡＣＧ－３　和５　一　ＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＡ￣ＡＧＧＡＧＧＡＡＧＴＡＧＣ－３　．扩增片殷为５２３　ｈｐ，　为代表的高通量检测的需求。在本研究中，我们通过ＬＣＭ　从癌组织中精确分离目的细胞结合高可信度垒基因组扩增　技术（ｈｉ　蜘ｅｈｔｙ－ｗｈｏｌｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ，ＨＦ－ＷＧＡ），建立一　基金项目：国家重点基础研究发展规划（９７３】基金资助项目　均由宝生物工程（大连）有限公司合成。主要仪器有ＬＭ２００　型ＬＣＭ系统（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ、美国Ａ－￣ｃｔｕｒｕｓ　Ｅ　Ｉ响ＵＮＯＩＩ型ＰＣＲ仪（Ｂｉｏｍｅｔｒａ公司）。　公司），　（Ｇ１９９￣１２０３）；教育部高等学校优秀青年教师教学科研奖励计划　（１９９９年度）贷助项目　作者单位　１１０００１沈阳，中国医科大学卫生部细胞生物学重点实　２比Ｍ：新鲜胃癌切除标本，立即分别切取正常胃、原发　癌灶以及转移淋巴结组织，ＯＣＴ包埋．放人液氨中保存。８　ｇｍ厚连续冷冻切片，按ＮＩＨ推荐程序［引行ＨＥ染色。将第　一验室【王振宁（现在第一临床学院肿瘤科，１１０００１）、马琳、姜莉、张成　洪、何向民、张学］，第一临床学院肿瘤科（撩惠绵、陈竣青）　通信作者：张学　张封片镜下明确病理诊断，其余切片不封片。采用Ｉ￣２００　鞲　维普资讯 http://www.cqvip.com

中华病理学杂志２ＯＯ２年２月第３１卷第１期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｐａｔｈｏ１．Ｆｅ　２∞２，Ｖｏ］３１，Ｎｏ　１　圈１　ＩｃＭ连续发射激光束脉冲捕获单一腺管眦ｘ　２００．（左上）显微切割前组织象；（右Ｊ：）ｂＣＭ发射激光眯冲象；（左下）显傲切割后组织　象．目的腺昔被捕获后留下空白｛（右下）被捕获隙管的组织象　圈２　ＬＣＭ单撬间断发射激光柬脉冲捕获单十细胞皿ｘ　２ＯＯ，（左上）显　擞切割前组织象，白色箭头示目的细胞；（右上）ＬＣＭ发射激光脉冲象；（左下）显微切割后组织象，红色箭头示目的细胞被捕获后留下空白｛　（右下）被捕获细胞的组织象　型ＬＣＭ系统．激光束直径７．５坤－、能量５０　ｍｗ，分别获取正　１　ＬＣＭ定量分离单一类型目的细胞（群）：ＬＭ２００型ＬＣＭ　常胃黏膜细胞、原发灶癌细胞、转移淋巴结癌细胞至覆盖乙　烯乙酸乙烯醋薄膜的塑料帽表面，每份标本各发射５００次和　５０次激光脉冲　３．ＤＮＡ提取｝将塑料帽盖于预先加有５０　裂解缓冲液　（１　ｘ　｜Ｉ１：　．　缓冲液，４　ｌｎ　ｍｌ蛋白酶Ｋ，５％Ｔｗｅｅｎ２０）的０　５　系统，显傲镜下定位，发射直径７　５脚、瞎量５０　ｍｗ的激光　束脉冲能够捕获单个细胞。可以准确地将癌细胞从原发灶　或转移淋巴结组织中分离出来，并可精确计数获取的细胞　数。图１示连续发射激光束脉冲捕获单一腺昔的结果；图２　为单欢间断发射激光束脉冲捕获单个细胞的结果。分别捕　获５００个和５０个细胞制备ＤＮＡ样品用于进一步研究。　２　ＨＦ－ＷＧＡ：ＬＣＭ捕获细胞经５０　裂解缓冲液处理制备　ＤＮＡ样品，取５　进行ＨＦ－ＷＧＡ。扩增后从总反应体积（ｓｏ　）中取１０　进行琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭ＥｔＢｒ显色，　ＩＩＩｌ离心昔（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）上。倒置离心管，４８℃水搭　１４　ｈ，９４℃１０　ｍＪｎ终止反应。　４．Ｈ￣ＷＧＡ：在Ｚｈａｎｇ等＿４　建立的引物延伸预扩增ＰＣＲ　（　ｍｅｔ－ｅｘｔｅａｓｉｏｎ　ｐｒｅａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ＰＣＲ，ＰＥＰ－ＰＣＲ）方法基础上略　作改进，具体步骤如下：取５　ＤＮＡ样品，加入１０×　可观察到明显的　静片（ｆｌＢｌｆｅ￣ｒ）”样荧光信号。５００个细胞组　亮度强于５０个细胞组．而无菌双蒸馏水对照组亦可见浅的　滁片”样信号（图３）。　３　ＨＦ．ＷＧＡ产物的ＰＣＲ检　测：从５０　全基因组扩增后的反　应体系中各取１　做ＤＮＡ模板，　利用各自引物分别扩增不同长度　的　ｃｉｉ￣ａ２Ｊｎ、ＩＤＩＢ和ｐ２１基因片　Ｐ肿ｂｅＢ　缓冲液５　，１００　Ｉｍｌｏｌ／Ｌ的１５个接苷酸随机引物　（Ｎ１５）１０　，２　５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄ　４　和Ｐｙｒｏｂｅ　ＤＮＡ聚台酶　１　，最后加水使反应体积为５０　。　无菌双燕水为阴性对　照，于ＵＮＯＩＩ型ＰＣＲ仪扩增５０循环：９４℃变性１　ｍｉａ，３７℃退　火２　ｒａｉｎ，　０．１℃／ｓ速率缓慢升温至　℃，延伸４　ｒａｉｎ后．再　升温至６８℃１　ｒｌｌｉＩｌ。经１％或２％琼脂糖凝胶电泳，紫外透射　仪上观察、照相　５．ＨＦ－ＷＧＡ产物中特定基因的ＰＣＲ检测：　正常人外周　血白细胞基因组ＤＮＡ为阳性对照，ＰＣＲ扩增￣－ｅａｔｅｎｉｎ、ＩＬ－１Ｂ、　ｐ２１基因片段，　检测ＨＦ．ＷＧＡ产物的代表性。１０×ＰＣＲ缓　冲液２一，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ１．６　，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚台酶０　１　．１０　￣ｍｏｌ／Ｌ的引物混合物４　以及ＨＦ．ＷＧＡ产物１　，最终加水　至２ｏ　。　ｃ砒ｅｎｉｎ基因扩增在９４℃变性１　ｒａｉｎ后，９４℃２０　ｓ、　６ｏｏｃ２ｏ　ｓ、７２℃３０　ｓ　３５个循环，最后７２℃延伸５　ｍＪｎ　ＩＬ－ＩＢ基　因扩增在９４℃变性１　ｍｉｎ后，９４℃３０　ｓ、５５℃３０日、７２℃１　ａｒｉａ　３５　个循环，最后７２℃延伸７『ｌｌｉＩｌ。ｖＺｌ基因扩增在９４Ｔ：变性１　ａｒｉｎ后，９４℃３０　、６８Ｔ：２『ｌｌｉＩｌ　３５个循环，最后６８℃延伸３ⅡＩｉｎ。　诛道１：５００十细胞组；泳　道２：５０十细胞组；泳道　３：无菌取蒸馏水对］！｝【组　圈３　Ｈ￣ＷＧＡ琼脂糖　段。结果显示，各实验组均可见　与阳性对照组位置一致的电泳条　带（图４）。５００个细胞组亮度强　于５０个细胞组，而无菌双蒸馏水　组则未见基因扩增产物。　三、讨论　肿瘤的发生和发展是多基　因、多阶段的复杂病理过程。从　分子水平研究肿瘤细胞基因结构　和表达的动态变化，具有重要的　Ｗ，２Ｒ产物分别经２％或１　５％的琼脂糖凝胶电泳，紫外透射　仪上观察、照相。　二、结果　理论和应用价值。但肿瘤细胞并　非孤立存在于组织中，而是依存　撬胶电泳结果　维普资讯 http://www.cqvip.com

理学杂志２ＯＯ２年２月第３１崔蔓　塑　堕　！！　垫　！　翌　以降低普通Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶在复制过程中的内源性错误。　结果表明　改进的ＰＥＰ－ＰＣＲ不仅能有效地扩增ＤＮＡ，而且基　左　扩增　哪舢ｎ基因片段；中：扩增ＩＬ－１Ｂ基因片段；右：扩　一　，本保持了基因组ＤＮＡ的　原貌”，后续的ＰＣＲ能够扩增出与　阳性对照组一致的￣－ｃａｔｅｎｉｎ、ＩＬ－１Ｂ和ｐ２１基因片段。　将ＬＣＭ获取的５００个细胞裂解于５０　缓冲痕中．取５　（５０个细胞）进行垒基因组扩增。再从５０　的反应体系中取　１　（１个细胞）ＤＮＡ进行后续的ＰＥＰ，检测　∞个细胞组的结　果显示，太致相当于１个细胞可进行１０次后续的ＰｃＲ捡测。　可见，ＨＦ－ＷＧＡ明显提高了原初细胞的利用效率．能够满足　同一样品多次多项ＰＣＲ检测的需要。　仅根据琼脂糖电泳结果，无法推测经ＬＣＭ取材垒基因　增Ｐ２１基园片段：泳遭１：正常＾井周血白细胞基园组ＤＮＡ　即阳性对照组；泳道２：５００个细晦组｝泳道３：５０个细胞组；　组扩增的产物中基因组片段的长度．因为５０十扩增循环后　ＤＮＡ的量依然很低，但其中一些片段的长度一定大于５２３　即本实验中扩增出的ｐ２１基因片段长度。这一片段长度　本实验中ＬＣＭ细胞垒基因组ＤＮＡ扩增，无菌双蒸水对　泳遭４：无菌双蒸馏木对照组；Ｍ：标志物　圈４　ＨＦ－ＷＧＡ后ＰＣＲ产物琼脂糖凝腔电泳结果　也足以满足目前大部分常规分子生物学检测技术的要求。　于多种不同类型细胞相互构成的三维空间中。用传统方法　从唐碎组织中提取ＤＮＡ、刚Ａ，因各种细胞成分混杂难免造　照组亦可见浅的　涂片　样信号，可能是由于１５个棱苷酸随　机引物自身聚合、扩增造成的　无菌双蒸馏水ＨＦ－ＷＧＡ产物　的ＰＥＲ检浏未见目的基因条带的结果支持我们的观点。　ＰｃＲ检测结果发现有轻微的涂片样荧光背景，可能是由于使　用的ＤＮＡ摸板来源于垒基因组扩增的反应体系，原有的引　物难免在ＰＣＲ循环过程中继续扩增形成轻微的背景污染，　但不影响结果观察和判定。在对ＤＮＡ要求较高的实验中，　如基因甲基化检弱等，可先纯化全基因组扩增后的ＤＮＡ．再　行柱测。　总之，我们的研究将ＬＣＭ与改进的全基因组扩增技术　成检测结果的偏差。肿瘤细胞系的建立和应用解决了肿瘤　组织中正常细胞的污染和干扰问题，但体外培养的瘤细胞不　能准确地反映实体组织中瘤细胞的生物学特性。因此，肿瘤　组织中细胞的异质性已成为分子病理学和肿瘤基因组学研　究的突出问题。尽管流式细胞技术能成功地分选悬浮的异　质细胞，但对分选实体肿瘤细胞则仍存在技术限制。　１９９６年美国ＮＩＨ　Ｌｉｏｔｔａ实验室首先开发了ＬＣＭ技术，次　年该技术相关设备及应用软件商品化，并迅即成为美国肿瘤　基因解剖计划（Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｒ￣ｔｏｍｙ　Ｐｒｏｊｅｃｔ，ＣＧＡＰ）的支撑　技术之一。我们的研究结果显示ＬＣＭ技术可以从胃癌原发　相结合，具有简便、精确、高教、可靠等特点，可广泛应用于肿　瘤细胞或其他细胞基因突变、甲基化、杂合子丢失、徽卫星不　稳定性和ＤＮＡ芯片等检测，其应用将有助于肿瘤基因组学　和分子病理学研究。　参ｌ　Ｂ　Ｍ．￣ｅｌａｖｄ　Ｉ　灶和转移琳巴结中简便快捷地识别并捕获单个癌细胞和单　一腺臂，从而避免了异质细胞对宴验结果的干扰，尤其早期　淋巴结转移，癌细胞仅局限于边缘窦中，淋巴细胞数量上占　绝大多数，常规方法根本无法进行杂合子丢失等检测，结果　考文献　．Ｍｉｃｒｏｂｅｍｎ　ＭＯＭｅＮＴ：Ｉ－０ｎ．　判定误差甚大¨］　ＬＣＭ技术不仅能有效地解脒细胞异质性　造成的偏差，而且能够精确计数获取的细胞数量（１扶激光　Ｉ￣ｌｕｅ　Ｋ。ｅｔ　ｃｏｎ￣ｌ１聃盯ｒｍｃｒｏｄｉｍｅｅｔｉ￣０ｆ　ｍｔｍａｈ＇￣ｅ・ｍ　Ｉ　ｐａｔｈｏｌ，ｌ９卯，１５１：６３・６７　２　Ｅ￣ｅｔｔ＊－Ｂｕｖｋ　ＭＲ，Ｂ—ｒ　ＲＦ．蜘　ｎ拍ｖｅ　ｔｉｍ　Ａｎｎ】　脉冲可捕获１个细胞）。　但是，ＬＣＭ技术分离目的细胞的数量有限，从中提取的　微量ＤＮＡ，仅能进行几次ＰＣＲ检测，不能满足肿瘤基因组学　研究（特别是高通量检测技术）的需求。针对这一问题，我们　对Ｌ￡Ｍ分选的细胞进行高可信度全基因组扩增　ＰＥＰ－ＰＣＦ（　是１９９２年Ｚｈａｎｇ等　建立的全基因组扩增技术．我们的　ＰＤ，ｅｔ　ａ１．Ｌａｔｅｒ瑚衄　耐　ｔ岫＿Ｓｅｉｅｎｅｅ．１９９６．２７４：９％一１∞１　３　ｈｔｔｐ：／／ｄｉｒ　ｎｉｅｈｄ．ｎｉｈ　ｇｏｖ／ｌｅｍ／ｌｅｍ　ｈｔｍ　４　ｚ１ｌ且ｎｇ　Ｌ．ＣｕｉＸ，￥ｃｋｍｉｔｔ　Ｋ，　．ｗｂ０１ｅ　ｇｔｍｏｍｅ曲ＩｐＩ击哪ｄ曲　岫Ｂ　￣ｉｎｇｌ￣ｃｅｌｌ：ｉｍｐｋ　０ｎｓｆｏ￣ｇｅｔａｂｌｅ舢　出血Ｐｒｏｅ　ＮａｌＡｃａｄ　ｉＳｅｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ，　ｌ９９２，８９：５　５８５ｌ　５　Ｂ０　Ｍ，Ｗｉｅｌ￣，ｄ　Ｉ　Ａｎｓｉ州Ｂ　ｔ啪０卜。ｐｅｃｉ　ｌ豇“曲ｉｎ　ｍ￣ｉｖｅ　，　ＨＦ－ＷＧＡ￣了如下改进：（１）用Ｐｙ脚ｂ髑　缓冲液和蛋白酶Ｋ、　Ｔｗｅｅｎ　２０配制裂解缓冲液，取代ＮＩＨ推荐的裂解缓冲液配　方，最大限度地保持ＷＧＡ反应体系中缓冲液成分的一致性，　以提高反应效能；（２）使用高可信度．ＰｙｒｏｂｅｓｔＭＤＮＡ聚合酶，Ｔ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｂｙ　ＰＣＲ｛ｈｏｗ　ｔｏ　ＦＩ，ｅｅｕｒｅ　ｔｈｅ　ＩＩ！，￣ｌｆＯＦ　ｃｅｌｌｓ／ｎｔ　Ｉ　Ｏ￣ｅｏｌ，１　１０：ｌ３ｌ・１３９．　（收稿日期：２００１．０７４）４）　（本文编辑：常秀青）　．鬟