免疫学实验-凝集试验

颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。

细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。

凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。 [目的要求]

1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。 2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。

3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。 [材料与试剂]

1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。

2. 灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。

3. 布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。

4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。 [实验内容及操作方法]

（一）试管凝集试验

以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。

1. 试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试

管架上。如被检血清有多份，对照只需做1份。

2. 被检血清稀释：第1管加入2.3 ml 0.5% 石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2 ml ，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5 ml 弃之，再吸取0.5 ml 加入第2管中，混匀后吸取0.5 ml 加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5 ml （见表1-1）。该被检血清的稀释度分别是1:12.5、1:25、1:50、1:100。

3. 对照管制作：第5管中加0.5% 石炭酸生理盐水0.5 ml ，第6管加1:25稀释的布氏杆菌病阳性血清0.5 ml ，第7管加1:25稀释的布氏杆菌病阴性血清0.5 ml 。

4. 加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5% 石炭酸生理盐水作1:20稀释，每支试管加0.5 ml 。

表1-1 布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单位：ml）

试 管 号 最终血清稀释度 0.5%石炭酸生理盐水 被检血清 抗原(1：20) 1 1：25 2.3 0.2 0.5 2 1：50 0.5 0.5 0.5 3 1：100 0.5 0.5 0.5 4 1：200 抗 原 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1：25 0.5 0.5 1：25 0.5 0.5 5 6 对 照 管 阳性血清 阴性血清 7 弃1.5 弃0.5 5. 感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中4-10h，取出后置室温18-24h（或37℃温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37℃温箱中22-24 h取出），然后观察并记录结果。

6. 结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。

＋＋＋＋：100％抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。

＋＋＋：75％抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。

＋＋：50％抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显

的凝集）。

＋：25％抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。 －：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。

7. 判定标准：能使50% 抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。

牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1:100，判为阳性，1:50的凝集价判为疑似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性，1:25的凝集价判为疑似反应（可疑）。 [注意事项]

1. 实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。

2. 结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。

（二）布氏杆菌病平板凝集试验

1. 加血清：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格（4cm），并注明被检血清号码，以100L微量可调加样器按下列量加被检血清于方格内，第l格80L、第2格40L、第3格20L、第4格10L。血清用前需放室温，使其温度达20℃左右。每一份检样需换一个tip头。

大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用40L 和20L ；猪、山羊、绵羊、狗用80L和40L。

2. 加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗原30L，滴在血清附近，而不与血清接触。从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签。

抗原用前摇匀，并置室温使其温度达20℃左右。

3. 作用：混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到30℃左右，3-5min内记录反应结果。

4. 对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照。 5. 结果判定：按下列标准记录反应结果。

＋＋＋＋：出现大的凝集块，液体完全透明，即100% 凝集。

2

＋＋＋：有明显凝集块，液体几乎完全透明，即75% 凝集。 ＋＋：有可见凝集块，液体不甚透明，即50% 凝集。 ＋：液体混浊，有小的颗粒状物，即25% 凝集。 －：液体均匀混浊，无凝集现象。

6. 平板凝集试验与试管凝集试验的关系见表1-2。

表1-2 平板凝集试验与试管凝集试验的关系

平 板 凝 集 相当于试管凝集

80L 1:25

40L 1:50

20L 1:100

10L 1:200

7. 判定标准：同试管凝集试验。

8. 注意：对于阳性及可疑的被检血清需用试管凝集试验进行验证。 （三）虎红平板凝集试验

这种试验是快速平板凝集试验。抗原是布氏杆菌加虎红制成。虎红平板凝集试验可与试管凝集试验及补体结合试验效果相比，具有操作简单、快速、特异性强的优点。

1. 被检血清和布氏杆菌病虎红平板凝集抗原各30L滴于玻璃板的方格内，每份血清各用一支牙签或火柴棒混合均匀。在室温（20℃）4-10min内记录反应结果。同时以阳、阴性血清作对照。

2. 结果判定：在阳性血清及阴性血清试验结果正确的前提下，被检血清出现任何程度的凝集现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。

3. 注意：抗原用前充分摇匀，抗原和被检血清用前应放室温30-60min后再进行试验。

（四）鸡白痢平板凝集试验

1. 被检鸡血清和鸡白痢平板凝集抗原各1滴（约30L）滴于玻板或载玻片上，用牙签或火柴棒充分混合。

2. 结果判定：在室温（20℃）下，观察30-60s，凝集者为阳性，不凝集者为阴性。

[思考题]

1. 凝集反应的原理是什么? 2. 哪些因素影响细菌凝集试验?

3. 凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？

实验二 病毒的血凝及血凝抑制试验

有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 [目的要求]

掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。 [材料与试剂]

1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50L定量移液器，滴头，微型振荡器。 2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。

3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。 [实验内容及操作方法]

（一）血球凝集(HA)试验

1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L生理盐水。

2. 于左侧第1孔加50L病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50L；第12孔为红细胞对照。

3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。

表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：L）

孔 号 病毒稀释度 生理盐水 病毒液 1 1:2 50 50 2 1:4 50 50 50 3 1:8 50 50 50 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 弃50

50 0.5%红细胞 50 结果观察 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ + + - -

4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。

以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。

(二) 血球凝集抑制(HI)试验

1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。 2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50L生理盐水。

3. 第１孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50L，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 „„ ；第12孔加新城疫阳性血清50L，作为血清对照。

4. 自第1孔至12孔各加50L 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。

5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50L，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。

表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L）

孔 号 血清稀释度 生理盐水 被检鸡血清 4单位病毒 室温中静置 10 min 0.5%红细胞 弃去50 结果观察 - - - - - - + ++ +++ ++++ ++++ - 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 1 1:2 50 50 50 2 1:4 50 50 50 3 4 5 6 7 8 9 10 11 病毒 对照 50 50 12 血清 对照 50 50 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。

以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。

从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。

附 录

1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液

枸橼酸钠（5H2O） 0.80g 枸橼酸（H2O） 0.055g 葡萄糖 2.05g 氯化钠 0.42g 双蒸水 加至 100 ml

将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115℃灭菌10min,4℃保存备用。

2. 0.5% 鸡红细胞制备方法

先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的1／5)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5% 鸡红细胞悬液。

3. 96孔微量反应板的清洗

将浸泡有75% 乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37℃温箱中干燥。

[思考题]

1. HA和HI试验的原理是什么？

2. HI试验是不是特异的抗原抗体反应，为什么? 3. HA和HI试验有何实际应用意义？