293T细胞中包装慢病毒的方法

慢病毒包装实验计划之老阳三干创作

时间：二O二一年七月二十九日 实验步调

一、

细胞培养

用含10% FBS的H-DMEM培养基于37 °C、5% CO2培

1、

养箱中培养293T细胞,其中加100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和10μg/ml ciprofloxacin避免支原体污染,

2、

待10cm皿中细胞融合度到80%左右,用0.25%胰酶消化

293T细胞,分到两个6cm皿中,另一盘10cm 293T作同样处理,使细胞在接种之后的18-24 h达到70%融合度.

●注意事项

293T细胞转染慢病毒24h之前,培养液中停止使用抗生素和ciprofloxacin,减少对病毒转染的影响；注意接种后的293T细胞密度,过高和过低的细胞密度都会导致转染后细胞死亡.

二、

细胞转染

每个6-cm培养皿在转染之前4 h用5 ml 不含血清的

3、

H-DMEM培养基换液,

4、

应用500 μl Optimum和14.18 μl

Lipofactamine2000混匀于室温静置5 min,将500 μl Optimum、1.7 μg 慢病毒载体、1.13 μg psPAX2和0.57 μg MD2.G混匀配制成DNA mixture,然后与静置5 min的Optimum/Lipofactamine2000混匀,于室温静置20 min后,

时间：二O二一年七月二十九日

时间：二O二一年七月二十九日

将混匀后的mixture加入到培养基中.

5、

6 h之后将培养基改换为含10% FBS的H-DMEM完全培

养基,

6、

辨别收集48h、72h和96h的细胞上清液.

●注意事项

①293T细胞容易脱落皿底,加H-DEME沿皿侧壁缓慢加入,并且边加边轻微摇晃使培养基均匀散布皿底避免细胞无培养基死亡

②质粒换算要准确,

③将mixture加入培养基中要边滴边摇晃培养皿使其mixture与培养基混匀,这样直至结束.

时间：二O二一年七月二十九日 时间：二O二一年七月二十九日