GAL4/VP16融合人工转录因子的活性研究

GAL4/VP16融合人工转录因子的活性研究

张 萍1，应 磊1，钱关祥1，徐 让2

【摘 要】［摘要］目的 构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体和含有上游激活序列(UAS)启动子驱动报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达载体组成的GAL4/VP16-UAS系统，观察融合转录因子GAL4/VP16的活性。方法 构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体pcDNA3-GAL4/VP16，含有5个拷贝UAS串联排列序列和腺病毒E1b基因核心启动子的人工杂合启动子驱动报告基因EGFP的表达载体pGL3-G5E1b-TATA-EGFP，利用脂质体将两种载体瞬时转染Hep3B和HEK293细胞，48h后采用RT-PCR和流式细胞术检测EGFP的表达，观察GAL4/VP16融合转录因子对G5E1B-TATA的转录调节作用。结果 在GAL4/VP16融合转录因子存在的情况下，G5E1b-TATA启动子活性明显上调，甚至可以达到巨细胞病毒(CMV)启动子的活性程度。结论 GAL4/VP16融合转录因子具有上调G5E1B-TATA启动子转录活性的作用，并且该转录活性足以达到驱动下游目的基因高效表达的水平，在基因治疗和基因功能的研究中具有一定的应用潜力。

【期刊名称】上海交通大学学报（医学版）

【年(卷),期】2013(033)004

【总页数】5

【关键词】［关键词］GAL4/VP16;人工转录因子;增强型绿色荧光蛋白

人工转录因子是人为构建的，在自然界中并不存在，具有新的序列特异性和作用效果。它可以将2种天然转录因子的DNA结合结构域和效应结构域进行组合得到新的融合蛋白，亦可模拟天然转录因子的DNA结合结构域和效应结构域设计合成新的转录因子。人工转录因子通过识别DNA上的结合位点在转录水平调控目的基因的表达，可通过少量的人工转录因子起到良好的调控效果，在基因功能的基础研究、药物设计以及基因治疗等领域均有广泛应用［1－3］。

酵母转录调节蛋白GAL4是一种调控真核细胞内基因表达的工具，与上游激活序列(up-stream activating sequence，UAS)结合后激活靶基因的转录，GAL4-UAS系统已被广泛应用于基因表达调控的研究［4，5］。人工合成的融合转录因子 GAL4/VP16是对酵母转录因子GAL4蛋白改造后的产物，用VP16的激活结构域替换GAL4的激活部位，含有GAL4蛋白的DNA结合结构域和单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域具有更强的调节功能［6］。

本研究构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体和含有UAS序列启动子驱动报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的表达载体，组成GAL4/VP16-UAS系统，转染细胞后观察融合转录因子GAL4/VP16的活性，为该系统进一步在基因功能研究、基因治疗等领域中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 肝癌细胞株Hep3B、人胚肾细胞株HEK293来自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.1.2 菌种和质粒 DH5α和pcDNA3购自Invitrogen公司。质粒 pcDNA3-EGFP、pGL3-G5E1b、pGL3-Basic-EGFP和pcmv-GAL4/VP16由应磊博士馈赠。

1.1.3 主要试剂和仪器 T4DNA连接酶、限制性内切酶、Klenow酶、100bp DNA Marker购自NEB公司;λDNA/HindⅢ DNA Marker购自 MBI Fermentas公司;DNA MarkerⅣ购自东盛科技公司;质粒DNA抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自QIAgene公司;dNTP和Taq DNA聚合酶购自Promega公司;TRIzol试剂、RNasin RNA酶抑制剂、M-MLV反转录酶、随机引物、Opti-MEM和Lipofectamine2000脂质体均购自Invitrogen公司;DMEM培养液购自Gibco公司，小牛血清购自Hyclone公司;其余试剂均为进口分装或国产分析纯。FACS Calibur流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3-GAL4/VP16表达载体的构建 pcDNA3经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后，琼脂糖电泳回收约5.4 kb的载体片段。pcmv-GAL4/VP16(应磊博士提供)经BglⅡ和 XbaⅠ双酶切后，琼脂糖电泳回收772 bp的GAL4/VP16融合基因片段。将两片段T4 DNA连接酶连接，构建含GAL4/VP16融合基因的表达载体，称为pcDNA3-GAL4/VP16。转化、扩增重组质粒，少量抽提质粒进行酶切、测序鉴定，鉴定正确后大量扩增重组质粒。

1.2.2 pGL3-G5E1b-TATA-EGFP 表达载体的构建质粒 pGL3-Basic-EGFP经 SacⅠ和HindⅢ双酶切后，琼脂糖电泳回收约4.0kb的载体片段。pGL3-G5E1b经SacⅠ和HindⅢ双酶切后，回收164 bp的G5E1b-TATA片段。将两片段T4DNA连接酶连接，构建pGL3-G5E1b-TATA-EGFP表达载体。转化、扩增重组质粒，少量抽提质粒进行酶

切、测序鉴定，鉴定正确后大量扩增重组质粒。

1.2.3 细胞培养和质粒转染 用含10%小牛血清的DMEM培养液，在37℃、5%CO2的条件下培养Hep3B和HEK293细胞。每孔接种2×105～5×105个细胞于6孔板中，培养24h后(细胞生长至80%～90%融合度)进行Lipofectamine2000脂质体介导的DNA转染，按照操作说明进行转染。将待转染细胞分成3组。实验组:共转染质粒pcDNA3-GAL4/VP16和pGL3-G5E1b-TATA-EGFP;阳性对照组:仅转染质粒pcDNA3-EGFP;阴性对照组:仅转染质粒 pGL3-G5E1b-TATA-EGFP。转染48h后裂解收获细胞，每组至少重复3次转染实验。

1.2.4 RT-PCR检测EGFP mRNA的转录 6孔板中的细胞转染48h后，按照说明书使用TRIzol试剂提取细胞总RNA。RNA反转录得到cDNA作为模板进行PCR扩增。扩增EGFP的引物序列:5'-CCATG GTGAGCAAGGGC-3'(上游);5'-CGCCGCTTTACTTG TAC-3'(下游);产物长度729 bp;扩增GAPDH的引物序列:5'-TGGGGAAGGTGAAGTCGG-3'(上游);5'-CTGGAAGATGGTGATGGGA-3'(下游);产物长度233 bp。反应体系50μL，扩增条件:95℃ 3min;96 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 90s，共 27 个循环;最后，72℃延伸10min。在进行 RT-PCR时，设置以mRNA为模板的空白对照组。

1.2.5 流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测 EGFP基因的表达 6孔板中的细胞转染48h后，经胰酶消化，用1×PBS洗涤细胞2次，含1%甲醛的PBS固定细胞后，流式细胞仪检测Hep3B和HEK293细胞株中EGFP表达阳性的细胞数和平均荧光强度。实验重复3次，选择3次实验中最典型的一次。

2 结果

2.1 重组质粒的鉴定

质粒pcDNA3-GAL4/VP16和pGL3-G5E1b-TATAEGFP通过酶切后电泳，酶切图谱证明质粒构建成功。pcDNA3-GAL4/VP16质粒经KpnⅠ和XbaⅠ酶切后得到5.4 kb的载体片段与788 bp的 GAL4/VP16片段(图1);pGL3-G5E1b-TATA-EGFP质粒经XbaⅠ单酶切后得到825 bp左右的TATA-EGFP片段，经XbaⅠ和NcoⅠ酶切后得到759 bp左右的EGFP片段，经SacⅠ和 NcoⅠ酶切后，得到197 bp左右的G5E1b-TATA片段(图2)。对质粒pcDNA3-GAL4/VP16和 pGL3-G5E1b-TATA-EGFP进行测序，证实GAL4/VP16融合基因、G5E1b-TATA-EGFP的序列正确。

2.2 Hep3B和HEK293细胞中EGFP基因的转录

2.2.1 RT-PCR法检测 在Hep3B和HEK293细胞中，共转染 pcDNA3-GAL4/VP16和 pGL3-G5E1b-TATA-EGFP质粒的细胞EGFP基因转录生成的mRNA表达量明显高于单独转染pGL3-G5E1b-TATAEGFP质粒的细胞，转录活性与巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子接近，提示GAL4/VP16融合人工转录因子能够高效地与G5E1b-TATA启动子作用，增强EGFP基因转录(图3)。

2.2.2 FCM检测 在Hep3B和HEK293细胞系中，实验组G5E1b-TATA启动子在GAL4/VP16融合转录因子存在的情况下，转录活性明显高于阴性对照组，甚至达到CMV启动子(阳性对照组)的活性(图4)。

3 讨论

人工转录因子可以进行模块化设计，通过改变DNA结合结构域灵活选择其作用靶

点，改变功能结构域对靶基因进行激活、抑制等产生不同的调控作用，具有简便、灵活的优点，广泛应用于基因功能研究、药物设计以及基因治疗等领域［1－3］。

酵母GAL4基因表达系统是目前了解最透彻的真核细胞转录调节系统之一，已经被广泛应用于基因工程的许多领域。在酵母中，GAL4基因的上游有一段上游激活序列(up-stream activating sequence，UAS)，UAS属于启动子近侧元件，其下游附近有一段类似于TATA盒的“AT”丰富区。酵母调节蛋白GAL4特异结合于UAS，然后使GAL1和GAL10基因特异转录［7，8］。在 UAS中，真正与 GAL4蛋白结合的核心部位是一段4个拷贝串联排列的重复序列，其中单个拷贝包括17个碱基对，序列为5'-CGGAG TACTGTCCTCCG-3'［9］。GAL4 蛋白通过 DNA 结合结构域(GAL4 DNA binding domain，GAL4 BD)特异地与这段序列结合进一步调节下游基因的表达。GAL4不存在于哺乳动物细胞内，并且只有在识别UAS时才能激活目标基因，使启动子下游基因转录，具有良好的特异性与可诱导性。这一系统在控制目的基因在培养的哺乳动物细胞中有序表达方面得到广泛应用，如在疱疹病毒介导的转基因实验中，用于控制不利的病毒基因的表达［10］;在动物实验水平，已成功应用于果蝇和转基因小鼠的基因靶向表达［11］。

为了将这一基因转录调节系统更好地应用于基因工程，人们对此作了一系列改造。首先，人工合成一段G5E1b-TATA启动子，包含了5个拷贝UAS串联排列序列和腺病毒E1b基因上游的核心启动子5'-TATATAA-3'。其中，核心启动子5'-TATATAA-3'能招募RNA聚合酶启动转录，但其活性较低;UAS序列能够与GAL4蛋白(反式作用因子)的DNA结合结构域结合，进一步通过该反式作用因子的转录激活结构域增强启动子的活性。我们采用5个拷贝的串联排列序列，比原始序列多了一个拷贝以增加转录因子与其结合的概率［12］。其次，融合转录因子GAL4/VP16，即将GAL4蛋白的DNA结合结构域和单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域(VP16 activating domain，VP16 AD)连接在一起，这样形成的融合转录因子在保持GAL4蛋白结合特异性的同时大大增加了 GAL4蛋白的激

活转录活性［13］。在本研究中，以 EGFP为报告基因，构建了 pcDNA3-GAL4/VP16和pGL3-G5E1b-TATA-EGFP两种质粒载体组成这一系统，在Hep3B和HEK293细胞中验证了这一系统的活性，并与阳性对照pcDNA3-EGFP作比较，发现当有该GAL4/VP16融合转录因子存在的情况下，G5E1b-TATA启动子活性在上述细胞系中都有明显上调，甚至可以达到CMV启动子的活性程度。研究结果证实GAL4/VP16融合转录因子具有上调G5E1B-TATA启动子转录活性的作用，并且该转录活性足以驱动下游目的基因高效表达，为进一步在基因治疗方面的研究奠定了基础。在今后的工作中，可以尝试将GAL4/VP16融合转录因子置于一些组织细胞特异性的启动子下，使GAL4/VP16融合蛋白在特定的组织细胞内表达，从而使G5E1b-TATA启动子驱动下的目的基因在该特定细胞内高表达，实现目的基因的可调控表达。

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［DOI］10.3969/j.issn.1674-8115.2013.04.005

［基金项目］国家自然科学基金项目(81070135)(National Foundation of China，81070135)。

Science Natural