便秘型肠易激综合征大鼠胃排空及胃内肌间神经丛神经元的变化

文章编号：1001-6325（2011）12-1301-04

基础医学与临床Basic＆ClinicalMedicineDecember2011Vol．31No．12

研究论文

便秘型肠易激综合征大鼠胃排空及胃内肌间神经丛

神经元的变化

*

杨希林，方秀才，刘晓红，李

珊，朱丽明，柯美云

（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院消化内科，北京100730）

摘要：目的通过评价便秘型肠易激综合征（IBS-C）模型大鼠胃排空率和胃肌间神经丛神经元的变化探讨肠神经

C模型大鼠（n=7），系统在功能性胃肠病重叠综合征发病机制中的作用。方法冰水灌胃法制作IBS-设对照组；采Hu）标记神经元总数，用酚红排空定量法测定胃排空率；取远端胃组织制作石蜡切片标本，采用抗神经核抗体（anti-Hu/乙酰胆碱转移酶（ChAT）、Hu/一氧化氮合酶（NOS）抗体行免疫组织荧光双染色，观察、计算特异性阳性神经元C模型大鼠ChAT阳性神占神经元总数百分比。结果冰水灌胃组大鼠胃排空率显著高于对照组（P＜0.05）。IBS-P＜0.05），NOS阳性神经元显著低于对照组（18.9%±经元显著高于对照组（79.0%±2.4%vs68.3%±1.0%，

5.0%vs33.1%±4.5%，P＜0.01）。结论冰水灌胃法制作的IBS-C模型大鼠胃排空及胃肌间神经丛神经元均存在改变，表明肠神经系统的变化可能是功能性胃肠病重叠综合征发病机制之一。

关键词：功能性胃肠病；重叠综合征；便秘型肠易激综合征；功能性消化不良；肠神经系统

中图分类号：R573.9

文献标志码：A

Thechangesofgastricemptyingandgastricmyentericneuronsinrats

withIBScomplicatedwithconstipation

YANGXi-lin，FANGXiu-cai*，LIUXiao-hong，LIShan，ZHULi-ming，KEMei-yun

（Dept．ofGastroenterology，PUMCHospital，CAMS＆PUMC，Beijing100730，China）

Abstract：ObjectiveToevaluategastricemptyingratesandchangesofgastricmyentericneuronsinratmodels

RatmodelswithIBS-Cwereestablishedbystomachir-

withirritablebowelsyndromecomplicatingconstipation（IBS-C），andtoinvestigatethepathogenesisroleofentericnervoussystem（ENS）inoverlappingsyndrome．Methods

ritationwithice-waterdailyfor14-days．Theratswerecheckedwithphenolredforgastricempty．Doublestainingwithimmunohistofluorescencewithanti-Huantibodyandcholineacetyltransferase（ChAT）ornitricoxidesynthaseswasappliedwithgastrictransversesectionpreparationstoevaluatetheproportionofspecificneuronsinmyentericplexusofthedistalstomach．Results

Thegastricemptyingrateat15minaftergastricgavageincreasedsignificant-lyinIBS-Cratscomparingtocontrol（P＜0．05）．TheproportionofChATimmunoreactive（ChAT-IR）neuronsinmyentericplexusofdistalstomachwashigherinIBS-Cratsthanthatincontrolgroup（79.0%±2.4%vs68.3%±1.0%，P＜0.05），whiletheproportionofNOS-IRneuronsdecreasedsignificantlyinIBS-Crats（18.9%±5.0%vs33.1%±4.5%，P＜0.001）．Conclusions

收稿日期：2010－02－25

*

Theentericnervoussystemmightplayanimportantroleinthe

修回日期：2011－07－22

“十一五”基金项目：国家科技支撑计划（2007BAI04B01）通信作者（correspondingauthor）：fangxiucai2@yahoo．com．cn

1302

基础医学与临床Basic＆ClinicalMedicine2011.31（12）

pathogenesisofIBS-Candfunctionaldyspepsia．ThisstudyprovidesanewinsightonunderstandingtheunderlyingmechanismsforFGIDsoverlapsyndrome．

Keywords：functionalgastrointestinaldisorders；overlappingsyndrome；irritablebowelsyndromewithconstipation；functionaldys-pepsia；entericnervoussystem

成人功能性胃肠病（functionalgastrointestinaldisorders，FGIDs）包括7大类28种病症，在FGIDs患者中症状重叠现象十分普遍，尤以肠易激综合征（irritablebowelsyndrome，IBS）合并功能性消化不良（functionaldyspepsia，FD）为常见。胃肠道多部位的动力障碍、

内脏高敏感、脑－肠轴调节功能异常以及精神心理障碍可能与重叠综合征的发生有关

［1］

。

肠神经系统（entericnervoussystem，

ENS）是保证胃肠道感觉、运动和分泌等复杂功能协调运行最重要的基础，从ENS角度来研究FGIDs重叠综合征的发生机制鲜见报道。本研究采用冰水灌胃法建立的便秘型IBS（IBSwithconstipation，

IBS-C）模型大鼠，通过免疫组织荧光双染法检测胃肌间神经丛神经元总数、

胆碱乙酰转移酶（cholineacetyltransferase，ChAT）阳性神经元和一氧化氮合酶（nitricoxidesyn-thases，NOS）阳性神经元的变化，探讨ENS在FGIDs重叠综合征发病中的作用。

1

材料与方法

1.1

材料

雄性Wistar大鼠14只，体质量120～140g，购

自北京维通利华实验动物技术有限公司，于北京协和医院SPF级动物房单笼饲养，室温20～24℃，12h/12h昼夜交替，自由进食进水。小鼠来源抗神经核抗体（anti-HuC/HuD，MolProbes）、山羊抗ChAT抗体、绵羊抗NOS抗体（Chemicon公司），Cy3标记驴抗小鼠二抗、

FITC标记驴抗山羊/绵羊二抗（美国俄亥俄州立大学JDWood教授赠送），FITC标记兔抗山羊抗体（北京中杉金桥公司）。1.2方法

1.2.1

IBS-C动物模型建立：大鼠随机分为2组，每

组各7只。参考文献［2］建立的造模方法。冰水灌胃组每日8时予冰水（0～4℃0.9%氯化钠注射液）灌胃，2mL/次，1次/d，共14d。对照组正常饲养。1.2.2

粪便性状检测：为避免急性应激反应的干

扰，冰水灌胃组收集灌胃后3h至次日8时粪便，同

时收集对照组大鼠粪便。计数两组大鼠粪便颗粒数，称干湿重量，计算粪便含水量。冰水灌胃组大鼠出现粪便颗粒数、粪便含水量下降，认为IBS-C造模成功。

1.2.3胃排空率的测量：采用酚红定量法测定胃排空率。冰水灌胃组第14天灌胃结束后，

二组大鼠禁食24h，予1.5mmol/L酚红液2mL灌胃。15min后颈椎脱臼法处死，开腹，血管钳结扎贲门和幽门，沿血管钳内侧离断胃。蒸馏水清洗胃表面血液，湿纱布擦干，将胃内残留酚红充分溶于15mL蒸馏水中，

定容至20mL。加入0.5mol/LNaOH溶液20mL，充分混匀。配不同浓度梯度酚红标准液。日立200-20型分光光度测定胃内色素残留量（λ=620nm），计算胃排空率。1.2.4

胃组织标本留取：将胃标本置于Krebs液中

清洗，

取远端胃1cm，滤纸上铺平，中性福尔马林液固定，石蜡包埋后连续切片，厚4μm，HE染色，封片，显微镜下观察远端胃组织学变化。1.2.5

免疫组织荧光双染法检测胃内肌间神经丛

神经元：连续切片中相隔5张取2张切片。切片脱蜡水化、

微波抗原修复；血清封闭10min，加anti-Hu（1∶100）/抗ChAT一抗（1∶200）或抗NOS一抗（1∶1000）混合液，4℃过夜，PBS漂洗；加Cy3二抗（1∶1000）/FITC二抗（1∶150），37℃放置1h，PBS漂洗，甘油封片。

荧光显微镜（Nikoneclipse80i）观察：每张切片随机连续计数3个不重合高倍视野（×200）内肌间神经丛神经节数、

anti-Hu阳性神经元总数、ChAT阳性神经元数或NOS阳性神经元数。1.3

统计学分析

数据以均值±标准差（x

—

±s）表示。使用SPSS13.0软件进行统计分析，组间比较采用两独立样本t检验。

2

结果

2.1

冰水灌胃后大鼠粪便颗粒数及含水量变化冰水灌胃组灌胃后3～24h粪便颗粒数由

杨希林便秘型肠易激综合征大鼠胃排空及胃内肌间神经丛神经元的变化

1303

（52.9±9.2）粒（灌胃第1天）降至（38.9±6.7）粒（灌胃第14天）；对照组大鼠同时间点粪便颗粒数由（54.4±8.1）粒降至（45.3±9.2）粒，冰水灌胃组粪便颗粒数较对照组显著减少（P＜0.01）。冰水灌胃组大鼠在粪便颗粒数减少的同时，粪便逐渐干硬，粪便含水量由38.2%±4.2%（灌胃第1天）降至30.0%±3.0%（灌胃第14天），对照组由40.0%±4.0%降至34.7%±5.1%，冰水灌胃组粪便含水量较对照组显著下降（P＜0.01）。表明冰水灌胃法造模成功。2.2

IBS-C模型大鼠胃排空率加快

IBS-C模型大鼠胃排空率明显高于对照组大鼠（89.0%±7.0%vs78.2%±5.8%）（P＜0.05）。2.3加

大鼠远端胃壁纵行肌与环形肌之间分布着丰富Hu抗体阳的肌间神经丛神经节，节内神经元anti-神经元聚集成团；胃黏膜下神经丛神经节极不发性，

达，偶见神经元。肌间神经丛ChAT阳性神经元均占神经元总数比例较高（图1）。ChAT为胞质染色，

阳性神经元比例（79.0%±2.4%）显著高于对照组（68.3%±1.0%）（P＜0.05）。2.4

远端胃肌间神经丛NOS阳性神经元比例减少大鼠远端胃NOS阳性神经元散在分布，荧光染NOS阳性神经纤维包绕肌间神大小不一，色较强，

C大经丛内神经节或纵横穿行于神经节之间。IBS-鼠NOS阳性神经元比例（18.9%±5.0%）显著低于对照组（33.1%±4.5%）（P＜0.01）。

远端胃肌间神经丛ChAT阳性神经元比例增

3讨论

IBS以腹痛/腹部不适伴排便习惯、粪便性状改

FD主要表现为餐后上腹饱胀、早饱、上腹变为特征，

部疼痛等，二者并存是常见的FGIDs重叠综合征

［3，4］

。IBS-C患者合并餐后上腹饱胀、早饱等胃动

［5－7］

胃固体和液体排空延缓，胃排空异常力障碍症状时，与FD症状密切相关

。重叠综合征不仅严重影

同时使病情复杂化，增加了诊治的响患者生活质量，

难度。研究和揭示FGIDs重叠综合征的病理生理机制，对更好地理解其临床表现，寻找有效的治疗方法具有重要意义。

C模型大鼠能部分本研究采用的冰水灌胃IBS-C排便习惯、内脏高敏感等特征模拟人类IBS-模型可重复性好

［8］

［2］

，该

。该模型大鼠在肠道功能改变

C重胃排空功能也出现异常，与临床上IBS-的同时，

叠FD类似。胃肌间神经丛同时调控胃的运动和分其神经元主要为胆碱能神经元（ChAT阳性泌功能，

神经元）和NOS阳性神经元（神经递质为NO）两前者为兴奋性运动神经元，释放乙酰胆碱和P种，

物质，引起肌肉收缩，促进蠕动，同时促进腺体分泌；NO是抑制性神经递质，NOS抑制主要参与胃舒张，剂可使大鼠和狗胃排空减慢

［9］

，表明神经递质的改

C模型大鼠远端胃肌间神变可以影响胃功能。IBS-抑制性经丛内兴奋性ChAT阳性神经元比例升高，NOS阳性神经元比例降低，这种变化可能是导致远影响协调运动，导致胃排空功能改变端胃收缩加强，的主要原因。

A.anti-Hupositiveneurons；B.ChATpositiveneurons；C.anti-Hu/ChATmerge

Fig1

Hu和ChAT阳性神经元免疫组织荧光双染图图1胃肌间神经丛anti-Doublestainingofimmunohistofluorescencewithanti-Hu/ChATinmyentericplexusofdistalstomach（scalebar=50μm）

1304

基础医学与临床Basic＆ClinicalMedicine2011.31（12）

实验中同时发现该模型大鼠肠道ENS神经元其同时出现胃排空异常、的改变（结果另文发表），

胃肌间神经丛神经元的改变，在一定程度上反映了ENS神经元的改变在FGIDs重叠现象中的可能作用。推测中枢与外周各种刺激因素可以通过胃肠道内ENS神经元的变化，影响胃和肠道感觉、运动和

分泌功能，引起广泛的临床症状，导致FGIDs重叠综合征的发生。该模型大鼠胃液体排空速率较正常C患者胃排空延缓的报道结果不对照组快，与IBS-尽一致

［6］

，可能与冰水灌胃本身对胃的刺激有关，

FD这也提示重叠现象的复杂性，应在临床中对IBS-重叠症状的特点和胃肠道功能进行深入的研究。

参考文献：

［1］宋志强，柯美云，王智凤，等．功能性消化不良重叠症

J］．中华消化杂志，状与精神心理因素关系的初步研究［2008，28：468－471．

［2］彭丽华，杨云生，孙刚，等．便秘型肠易激综合征新概念

．世界华人消化杂志，2004，12：112－模型的建立［J］116．

［3］孙艳芳，李延青，王亚平．功能性消化不良重叠肠易激

J］．胃肠病综合征患者的消化道症状和生活质量特点［2006，11：492－494．学，

［4］WangA，LiaoX，XiongL，etal．Theclinicaloverlapbe-tweenfunctionaldyspepsiaandirritablebowelsyndromebasedonRomeIIIcriteria［J］．BMCGastroenterol，2008，8：43．

［5］TalleyNJ，DennisEH，Schettler-DuncanVA，etal．Overlap-pingupperandlowergastrointestinalsymptomsinirritable

bowelsyndromepatientswithconstipationordiarrhea［J］．AmJGastroenterol，2003，98：2454－2459．

［6］Caballero-PlasenciaAM，Valenzuela-BarrancoM，Herrerias-GutierrezJM，etal．Alteredgastricemptyinginpatientswithirritablebowelsyndrome［J］．EurJNuclMed，1999，26：404－409．

［7］StanghelliniV，TosettiC，BarbaraG，etal．Dyspepticsymp-tomsandgastricemptyingintheirritablebowelsyndrome［J］．AmJGastroenterol，2002，97：2738－2743．

［8］徐俊荣，罗金燕，尚磊，等．大鼠肠易激综合征肠黏膜下

J］．中华消化杂志，2007，27：107神经丛可塑性的研究［－110．

［9］PlourdeV，QuinteroE，SutoG，etal．Delayedgastricemp-tyinginducedbyinhibitorsofnitricoxidesynthaseinrats［J］．EurJPharmacol，1994，256：125－129．

新闻点击活化免疫防御的维生素D分子

04-02）报道，据美国BIOCOMPARE科技新闻网（2010-最新研究数据揭露，科学家发现维生素D是免疫防御系统活化的一个关键，若缺少了维生素D帮助，那么免疫系统的主角、杀手T细胞就无法有效的活化，防御入侵体内的感染原。

据了解这次由哥本哈根大学（UniversityofCopenhagen）CarstenGeisler教授所主导的研究计划，发现体内防御入侵细菌或在接触到入侵的感染病原时，并不会立刻的反应，产生一些防御性的免疫反应，而一连串保护身体的防御病毒的主角T细胞，

机制，必须在这些T细胞表面的维生素D受体分子（vitaminDreceptor）接触到足量的维生素D时，免疫机制才会启动。

Geisler教授表示通过维生素D活化的T细胞，这时候会分裂出两种细胞，一种是可以摧毁带有入侵病原细胞的杀手T细胞，另一种则是产生帮助者（helper）细胞，来帮助免疫记忆功能的产生。

先前相关的研究虽然证实维生素D在体内具有相当多的功能，像是维生素D协助了体内钙离子运作平衡机制，维生素D在肿瘤细胞生理运作过程中也扮演着角色，但这次确认维生素D也是免疫活化的关键，则是新的一项突破。

维生素D是许多天然食物在消化过程中的副产物，也是生物个体在接触阳光时会产生的分子，那么对于常常感染疾病的人，多晒太阳也许是一个不错的选择。