牛乳中具纤溶活性碱性蛋白酶的研究

白英，陈振涛

摘 要：通过ε-氨基己酸的解离作用，利用CM Sepharose Fast Flow凝胶过滤层析、Lysine-Sepharose（赖氨酸-琼脂糖凝胶）亲和层析的方法，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度鉴定，从末乳中分离出一种具有纤溶活性的碱性蛋白酶。采用凝胶色谱和等电聚焦法对其分子量和等电点进行测定。结果表明：该蛋白酶为单体蛋白，纯化倍数2.11，分子量为47.0 ku，等电点7.8。纯化后酶的活性可完全被PMSF抑制剂抑制，属于丝氨酸蛋白酶家族。对酪蛋白具有一定的水解能力。 关键词：末乳；碱性蛋白酶；纤溶活性 0引 言

近年国内外对乳中内源性和外源性蛋白酶的研究十分关注。 原料乳中蛋白酶活

性在实际生产中具有重要影响。是UHT灭菌乳的贮藏和干酪成熟过程中的不稳定因素，并且产生的一些苦味物质会改变乳制品的感官特性。 碱性蛋白酶为内院蛋白酶系统中的主要成分。 国内外研究显示，对乳制品影响最大的为纤维蛋白溶酶。纤维蛋白溶酶(Plasmin, PL)是乳中固有的蛋白酶，属于碱性丝氨酸蛋白酶，在乳中与酪蛋白微粒相结合存在。在末乳期乳中含量较高。由于PL对酪蛋白的水解，破坏了乳蛋白的整体结构，使干酪组织状态变软，持水性差，而且有时由于水解不当，使干酪易带有苦味等不良风味，所以极大的影响着干酪的产量及品质。 1实 验 1.1主要试剂

V7127，三羟甲基氨基甲烷 （Tris），6—氨基己酸 ，CM Sepharose Fast Flow，

Lysine-Sepharose4B，抑制剂，Marker，F—Red高灵敏度蛋白质电泳快速染液。 1.2仪器

CF-15R离心机，DU800分光光度计， 真空冷冻干燥机，Fine-dox3 全自动凝

胶呈相系统， 低温层析柜，HD-4电脑核酸蛋白（紫外）检测仪，DYY-6C型电泳仪。 1.3方法

1.3.1样品处理及粗酶制备

将收集的牛末乳以2 000 g离心力，5 ℃下离心15 min脱脂。 脱脂乳中加入

浓度为50 mmol/L的ε-氨基己酸（EACA），室温下静置2 h。 参照Politis的方法，用1.4 nHCl将脱脂乳调至pH值为4.4~4.7，室温下静置10~15 min。 在水浴中加热到45 ℃。 将处理后脱脂乳在离心力9 391 g，4 ℃条件下离心15 min，将乳清进行冷冻干燥备用。

1.3.2纤维蛋白平板检测

采用改进的标准纤维蛋白平板法。 取直径为9 cm 的医用无菌培养皿 ， 置于

水平操作台上 ， 将1.5 mL质量浓度为7.5 g/L纤维蛋白原溶液、100 μL凝血酶溶液(42 U/mL)和8.3 mL质量分数为0.1 %的琼脂糖溶液(加热使完全溶解，并冷却至约

40 ℃)混合均匀，倒平板，室温下放置2 h。 浓度为50 mmol/L磷酸缓冲液( pH 值7.4)作为空白对照，将粗提酶和缓冲液分别置于灭菌牛津杯中，37 ℃温育18 h。 1.3.3 CM Sepharose Fast Flow凝胶过滤层析

将已经溶胀2 d的CM Sepharose Fast Flow装入层析柱(2.5 cm×80 cm)中，用

50 mmol/L磷酸缓冲液( pH值为7.4)充分平衡，5%粗酶样品上样量5 mL，分别用含0.1，0.3，0.5，0.7 mol的NaCl浓度为50 mmol/L磷酸缓冲液( pH值为7.4)洗脱,流速为0.2 mL/min，收集含有酶活性的组分。 1.3.4 Lysine-Sepharose（赖氨酸-琼脂糖凝胶）

亲和层析参照Humbert 和 Berbar 等的方法，装好Lysine-Sepharose4B亲和层析柱（1×10 cm），将50 mg冷干物溶于2 mL浓度为0.3 mmol/L（pH值为7.4）的磷酸缓冲溶液中， 将样液加入Lysine-Sepharose亲和层析柱，5 ℃下静止一段时间。 用同样缓冲液洗至基线。 以15 mL/h流速， 用含浓度为0.2 mol/L ε-氨基己酸（EACA）, 0.15 mol/L氯化钠的0.3 mol/L，pH值为7.4的磷酸钾缓冲溶液洗脱，收集活力峰。 1.3.5酶活性测定

以V 7127（H-D-valyl-Lleucyl-L-lyslylp-nitroa-dide ）作为底物，采用Korycka-Dahl等改良Rollema的方法对酶的活性进行检测。50 L待测样品与950 L浓度为50 mmol/L的Tris buffer (pH值为7.4)（含110 mmol/L的NaC1,0.6 mmol/L的V7127, 2.5 mmol/L的ε-aminocaproic acid）。 于37 ℃反应1 min，在波长405 nm处连续检测每分钟吸光值的变化。 不加样品的相似的反应体系做对照。 在所有的操作中，自发水解忽略不计。 酶的活力定义为：在405 nm下，1 mL反应液在1 min内吸光值改变0.001为一个酶活力单位。

1.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度鉴定

将纯化后冻干酶粉，配置成质量浓度为1.5 g/L的溶液。 采用凝胶质量浓度分别为7 g/L和120 g/L的垂直板电泳进行分析。 1.3.7蛋白质量浓度测定

将牛血清白蛋白配制成质量浓度为1 g/L的标准溶液。再配制成质量浓度为0，20，40，60，80，100，200 mg/L的牛血清白蛋白溶液。 再各取溶液1 mL，加考马斯亮蓝G-250溶液5 mL，摇匀。 常温下放置2 min后，用1 cm光径的比色杯在595 nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595，并做标准曲线。 通过标准曲线计算样品的蛋白质量浓度。 1.3.8分子量测定

采用凝胶色谱法测定分子量。色谱柱为1×25 cmSuperdex 200HR。 标准蛋白质分子量为： 细胞色素C（12.4 ku）、肌球素 （17.8 ku）、糜蛋白酶原 （25 ku）、 卵清蛋白（45 ku）、牛血清白蛋白（67 ku）、醛缩酶（160 ku）。室温下， 使用浓度为10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH值为7.5）平衡色谱柱，将不同分子量的蛋白标准

配制成1.5 g/L的质量浓度，进行凝胶过滤。 每种标准蛋白重复两次测定。上样量1 mL，流速0.6 mL/min。每种蛋白质Marker的洗脱体积Ve为样品开始洗脱到样品峰的中心位置时的洗脱体积。 再以蛋白质分子量的对数为纵坐标， 每种蛋白标准的洗脱系数Kav为横坐标绘制标准曲线。 将纯化后的蛋白酶（0.5 g/L）以上述同样条件通过色谱柱，测定其洗脱体积Ve和洗脱系数Kav。 通过标准曲线计算待测酶的分子量。 1.3.9等电点测定

用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦法来测定纯化后酶的等电点。以胶条长度为横坐标，pH值为纵坐标作图得到一条 pH 梯度曲线。 用下式计算蛋质聚焦部位至胶条正极端的实际

式中：L'为蛋白质的白色沉淀带中心至胶条正极端的长度；L1为测pH值的胶

条的长度；L2为固定后胶条的长度。 1.3.10抑制剂影响

将PMSF (1mmol/L),Leupeptin (1mmol/L),Apro-tinin(15 mmol/L),EDTA(10

mmol/L), E-64(100 μmol/L),Pepstatin(1 μmol/L) , DTT(100 mmol/L) 与纯酶室温下反应30 min。 不加抑制剂样品的相似的反应体系做对照。 测定酶活性。 1.3.11酶的酪蛋白水解性测定

称取一定量的酪蛋白， 用磷酸盐缓冲液溶解，调节其pH值为8.5。 反应液中

酪蛋白质量浓度为20g/L,加酶量为20 ML。 置于55 ℃的水浴中进行水解，在水解中监控pH变化并用浓度为1 mol/L的NaOH调节，待反应结束后，将反应体系立即置于沸水浴中，保持15 min， 终止反应 。 蛋白质水解度的测定参考pH-STAT法。水解度DH(％)= V·Mb·1/·1/Mp·1/h·100％，式中：V为水解过程中消耗的NaOH的量；Mb为 NaOH的浓度；Mp为为蛋白质总量；-为-氨基酸的解离度；h为每克蛋白质中肽键的毫摩尔数， 对于酪蛋白，该值取8.2。 2结果与讨论

2.1 CM Sepharose Fast Flow凝胶过滤层析结果

经含0.1，0.3，0.5，0.7 mol的NaCl的浓度为50 mmol/L磷酸缓冲液( pH值

为7.4)洗脱后，分别得到4个峰（见图1）。 对质量浓度较高的两个峰峰Ⅰ和峰Ⅱ进

行电泳检测，除目的条带外，还有杂带存在（见图2和图3）。 将两峰混合后，进行亲和层析，进一步进行纯化。

2.2 Lysine-Sepharose（赖氨酸-琼脂糖凝胶）亲和层

将CM Sepharose Fast Flow层析所获得峰Ⅰ和峰Ⅱ的混合物进行亲和层析，获

得单一峰（图4）。 经电泳检测为一条带。 纯化结果如表1所示。

2.3蛋白酶分子量

经分离纯化的蛋白酶样品，用SDS-PAGE测定其分子量。 电泳结果如图5所示。

结果表明，牛末乳中分离纯化所得到的纤维蛋白溶解酶为单体蛋白。 根据分子量与洗脱系数之间的关系y=-0.2237x+5.318， 求得 2.4等电聚焦法测定蛋白酶等电点

通过聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，根据公式y=-0.3932x+2.4737计算出该酶

的等电点pI=7.8。 该酶是一种碱性蛋白酶。 2.5抑制剂对酶的影响

表2为抑制剂对酶的影响。 由表2可以看出，1 mmol/L PMSF是唯一可完全抑

制酶活的抑制剂 。PMSF对于丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶具有很强的抑制作用。 该抑制剂可改变丝氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶的活性位点， 导致酶的活性完全丧失。当添加半胱氨酸抑制剂E-64 和 DTT时，检测结果并未显示有抑制作用。 因此，该纯化后的蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族。 2.6纤维蛋白平板检测结果

从纤维蛋白平板检测结果（见图6）可以看出，粗酶液具有明显的溶解纤维蛋

白聚集物作用，呈圆环状阴影。 可以初步证明该酶具有纤溶活性。 2.7酶的酪蛋白水解能力

在底物质量浓度20 g/L，pH值为8.5，温度为55 ℃，加酶量为20 L条件下，

酪蛋白水解度为25.13%。对酪蛋白具有一定的水解能力。 3结 论

利用CM Sepharose Fast Flow 凝胶过滤层析、Ly-sine-Sepharose（赖氨酸-琼

脂糖凝胶 ）亲和层析的方法，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度鉴定，凝胶色谱和等电聚焦法对其分子量和等电点进行测定，以及纤维蛋白平板检测。 从末乳中分离出一种具有纤溶活性的碱性蛋白酶。 该蛋白酶为单体蛋白， 纯化倍数2.11，分子量为47.0 ku，等电点7.8。 纯化后酶的活性可完全被PMSF抑制剂抑制，属于丝氨酸蛋白酶家族。 对酪蛋白具有一定的水解能力。 是否为纤维蛋白溶酶以及与血纤溶酶的关系还有待进一步研究。