(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 107727783 A(43)申请公布日 2018.02.23
(21)申请号 201710942505.3(22)申请日 2017.10.11
(71)申请人 上海中医药大学
地址 201203 上海市浦东新区蔡伦路1200
号(72)发明人 贾益群 刘娟 刘新华 陈龙
潘凌云 王夏雷 詹美榕 李云鹤 (74)专利代理机构 上海精晟知识产权代理有限
公司 31253
代理人 冯子玲(51)Int.Cl.
G01N 30/88(2006.01)
权利要求书1页 说明书7页 附图1页
(54)发明名称
一种肠道和粪便中短链脂肪酸的检测方法(57)摘要
本发明公开了一种肠道和粪便中短链脂肪酸的固相动态微萃取气质联用检测方法，包括以
置于下步骤：称取肠道内容物40mg或粪便100mg，
顶空瓶中，加入纯水1ml，涡旋振荡混匀；将所得的样品用于固相动态微萃取后用于气相色谱和质谱分析；并建立标准曲线进行定量分析。本发明的方法简化了样品的前处理步骤。只需将样本在纯水中均质，SPDE直接进行萃取，气相色谱与质谱联用分析，不需其他前处理步骤，能显著缩短测定时间，减轻实验工作量。本发明的方法的日内精密度RSD在5.29～9.92％，检出限在0.5～5μg·Kg-1，最小测定限在1～20μg·Kg-1。CN 107727783 ACN 107727783 A
权 利 要 求 书
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1.一种肠道和粪便中短链脂肪酸的固相动态微萃取气质联用检测方法，其特征在于，包括如下步骤:
(1)称取肠道内容物40mg或粪便100mg,置于顶空瓶中,加入纯水1ml,涡旋振荡混匀；(2)将步骤(1)所得的样品用于固相动态微萃取；
(3)将步骤(2)所得的产物用于气相色谱分析,条件为:色谱柱为VF-WAX ms,0.25mm×30m,0.25μm；升温程序为,初始温度70℃,保持l min,按10℃/min升温速率升温至200℃,保持2min,30℃/min升温速率升温至240℃,保持2min,进样口温度为250℃，载气是高纯度氦气,恒压进样,压力为14.135psi,流速为1.0mL/min,进样方式为不分流模式；
(4)将步骤(3)所得产物用于质谱分析,条件为:扫描范围m/z:30—300,溶剂延迟时间7分钟,传输线、离子源温度分别是250,300℃,倍增器电压值为1853V；
(5)标准曲线的建立,分别称取乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸这6种短链脂肪酸,加入纯水定容,配置短链脂肪酸的对照品溶液,用峰面积对应样品浓度绘制标准曲线。
2.根据权利要求1所述的一种肠道和粪便中短链脂肪酸的固相动态微萃取气质联用检测方法,其特征在于，所述短链脂肪酸为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸。
3.根据权利要求2所述的一种肠道和粪便中短链脂肪酸的固相动态微萃取气质联用检测方法,其特征在于，所述步骤(1)中固相动态微萃取的条件为：使用SPNd1-WAX-5056的萃取针头、萃取次数50次、预热平衡时间为3分钟、预热平衡温度90℃、萃取针温度95℃、萃取流速200μl/s、解析气体体积为1ml。
4.根据权利要求1所述的一种肠道和粪便中短链脂肪酸的固相动态微萃取气质联用检测方法,其特征在于，所述步骤(1)中固相动态微萃取采用的萃取头涂层为聚乙二醇。
5.根据权利要求1所述的一种肠道和粪便中短链脂肪酸的固相动态微萃取气质联用检测方法,其特征在于步骤(5)中,乙酸、丙酸浓度分别取20μg·Kg-1、50μg·Kg-1、100μg·Kg-1、200μg·Kg-1、400μg·Kg-1、800μg·Kg-1,异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸浓度分别取4μg·Kg-1、8μg·Kg-1、20μg·Kg-1、40μg·Kg-1、80μg·Kg-1、160μg·Kg-1、320μg·Kg-1,独立进样3次,测得峰面积取平均值,制作标准曲线。
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说 明 书
一种肠道和粪便中短链脂肪酸的检测方法
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技术领域
[0001]本发明属于分析化学领域,涉及肠道和粪便中短链脂肪酸的检测方法,尤其涉及肠道和粪便中短链脂肪酸的固相动态微萃取的气相色谱和质谱联用的定量检测方法。背景技术
[0002]短链脂肪酸是指碳链中碳原子数目小于6个的有机脂肪酸,主要包含八种,分别是乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸和异己酸。生物体内的短链脂肪酸主要为乙酸、丙酸和丁酸,约占短链脂肪酸总量的90～95％,这3种短链脂肪酸是结肠中主要的阴离子,可以促进水和钠的吸收,是结肠细胞氧化的燃料。
[0003]临床研究表明,短链脂肪酸具有调节肠道菌群平衡、改善肠道功能,以及抗肿瘤、抗炎和调控基因表达的作用。肠道中不同种属类型的细菌产生的短链脂肪酸的种类和数量各不相同,主要检测生物样品(主要是血液、尿液、粪便、肠道内容物、细胞培养液)中的短链脂肪酸的含量,可以反应肠道中肠道菌群的变化,可辅助临床疾病的诊断、治疗。因此,建立经济、快速、简便的短链脂肪酸的定量和定性检测方法、提高检测方法的灵敏度与扩大检测方法的样品应用范围极具意义。
发明内容
[0004]本发明目的在于提供一种简单、快速和准确的肠道和粪便中短链脂肪酸的固相动态微萃取的气相色谱和质谱联用的检测方法,尤其是一种简单、快速和准确的肠道和粪便中短链脂肪酸的固相动态微萃取的气相色谱和质谱联用的定量检测方法。
[0005]本发明提出的一种肠道和粪便中短链脂肪酸的固相动态微萃取气质联用检测方法,具体包括如下步骤:[0006](1)称取肠道内容物40mg或粪便100mg,置于顶空瓶中,加入纯水1ml,涡旋振荡混匀；[0007](2)将步骤(1)所得的样品用于固相动态微萃取；[0008](3)将步骤(2)所得的产物用于气相色谱分析,条件为:色谱柱为VF-WAX ms,0.25mm×30m,0.25μm；升温程序为:初始温度70℃,保持l min,按10℃/min升温速率升温至200℃,保持2min,30℃/min升温速率升温至240℃,保持2min,进样口温度为250℃；载气是高纯度氦气,恒压进样,压力为14.135psi流速为1.0mL/min,进样方式为不分流模式；[0009](4)将步骤(3)所得产物用于质谱分析,条件为:扫描范围m/z:30—300,溶剂延迟时间7分钟,传输线、离子源温度分别是250,300℃,倍增器电压值为1853V；[0010](5)标准曲线的建立,分别称取乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸这6种短链脂肪酸,加入纯水定容,配置短链脂肪酸的对照品溶液,用峰面积对应样品浓度绘制标准曲线。
[0011]本发明中,步骤(1)固相动态微萃取的条件具体为:使用SPNd1-WAX-5056的萃取针头、萃取次数50次、预热平衡时间为3分钟、预热平衡温度90℃、萃取针温度95℃、萃取流速
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200μl/s、解析流速25μl/s、解析气体体积为1ml。[0012]本发明中,所述短链脂肪酸为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸。[0013]本发明中,步骤(1)固相动态微萃取采用的萃取头涂层为聚乙二醇。[0014]本发明中,步骤(5)中,乙酸、丙酸浓度分别取20μg·Kg-1、50μg·Kg-1、100μg·Kg-1、200μg·Kg-1、400μg·Kg-1、800μg·Kg-1,异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸浓度分别取4μg·Kg-1、8μg·Kg-1、20μg·Kg-1、40μg·Kg-1、80μg·Kg-1、160μg·Kg-1、320μg·Kg-1,独立进样3次,测得峰面积取平均值,制作标准曲线。
[0015]本发明的优点在于只需将样本在纯水中均质,SPDE直接进行萃取,气相色谱与质谱联用仪分析,不需其他前处理步骤,较SPME而言,只需孵化3分钟,能显著缩短测定时间,提高分析效率,减轻实验工作量。本发明的方法日内精密度RSD控制在5.29～9.92％之间,满足定量分析的要求。本发明建立的粪便中的短链脂肪酸的方法的检出限在0.5～5μg·Kg-1之间,最小测定限在1～20μg·Kg-1之间。附图说明
[0016]图1为短链脂肪酸对照品的总离子流色谱图。色谱中的峰表示为:1为乙酸:2为丙酸:3为异丁酸；4为丁酸；5为异戊酸；6为戊酸。
[0017]图2为实施例2中人的粪便中短链脂肪酸的总离子流色谱图。色谱中的峰表示为:1为乙酸:2为丙酸:3为异丁酸；4为丁酸；5为异戊酸；6为戊酸。
[0018]图3为实施例3中小鼠肠道内容物中短链脂肪酸的总离子流色谱图。色谱中的峰表示为:1为乙酸:2为丙酸:3为异丁酸；4为丁酸；5为异戊酸；6为戊酸。具体实施方式
[0019]本发明将通过以下实施例作进一步说明。[0020]实施例1动态固相微萃取条件的优化[0021]取乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸标准品各20ul于5ml的容量瓶,纯水定容,作为母液。取母液500ul,纯水定容至25ml,分别取1ml于10ml顶空瓶中,平行3个样本,计算平均值。[0022]1、萃取头的选择:对PDMS+10％活性炭(PDMS/AC)、聚乙二醇(PEG)、5％联苯/95％二甲基聚硅氧烷(CT-5)进行筛选,实验条件是:平衡时间5分钟,平衡温度60℃,萃取次数50次,萃取流速200ul/s,解析气体体积1000ul,预解析时间30s,解析流速25ul/s,分别采用3种萃取头测定。响应值如表1:[0023]表1萃取头的选择
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从表中可以看出,PEG涂层的萃取头萃取效果最好,响应值最大,灵敏度最高,所以
选用SPNd1-WAX-5056的萃取针头。[0026]2、萃取次数的选择:实验条件是:SPNd1-WAX-5056的萃取针头,平衡时间5分钟,平衡温度60℃,萃取流速200ul/s,解析气体体积1000ul,预解析时间30s,解析流速25ul/s,测定萃取次数为30次、40次、50次时各化合物的响应值,如表2:[0027]表2萃取次数的优化
[0028]
[0029]
从表中可以看出,萃取次数为50次时萃取效果最好,响应值最大,所以选用萃取次
数为50次。[0030]3、平衡温度的优化:实验条件是:SPNd1-WAX-5056的萃取针头,平衡时间5分钟,萃取次数50次,萃取流速200ul/s,解析气体体积1000ul,预解析时间30s,解析流速25ul/s,测定平衡温度为60℃、70℃、80℃、90℃时的各化合物的响应值,如表3:[0031]表3平衡温度的优化
[0032]
[0033]
从表中可以看出,通过对平衡温度60℃、70℃、80℃、90℃的考察知,从60℃～90℃
各化合物的响应值增幅较大,温度达100℃时,趋于稳定。而且100℃为标准大气压下水的沸点,故选用平衡温度90℃。[0034]4、平衡时间的选择:实验条件是:SPNd1-WAX-5056的萃取针头,平衡温度90℃,萃取次数50次,萃取流速200ul/s,解析气体体积1000ul,预解析时间30s,解析流速25ul/s,测定平衡时间分别为1分钟、3分钟、5分钟、10分钟时各化合物的响应值,如表4:[0035]表4平衡时间的优化
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从表中可以看出,平衡时间分别为1分钟、3分钟、5分钟、10分钟时各化合物的响应
值并没有明显变化,但考虑到仪器取样与进样间的时间间隔,所以选用平衡时间3分钟。[0038]5、萃取流速的选择:实验条件是:SPNd1-WAX-5056的萃取针头,平衡温度90℃,萃取次数50次,平衡时间3分钟,解析气体体积1000ul,预解析时间30s,解析流速25ul/s,测定萃取流速分别为50ul/s、100ul/s、200ul/s时各化合物的响应值,如表5:[0039]表5萃取流速的优化
[0037]
[0040]
[0041]
从表中可以看出,萃取流速分别为50ul/s、100ul/s、200ul/s时各化合物的响应值
无明显变化,为保证萃取速度,所以选用萃取流速200ul/s。[0042]6、解析流速的选择:实验条件是:SPNd1-WAX-5056的萃取针头,平衡温度90℃,萃取次数50次,萃取流速200ul/s,解析气体体积1000ul,预解析时间30s,测定解析流速分别为10ul/s、25ul/s、50ul/s时各化合物的响应值,如表6:[0043]表6解析流速的优化
[0044]
从表中可以看出,(描述结果)解析流速分别为10ul/s、25ul/s、50ul/s时各化合物
的响应值无显著变化,但解析流速过大会增加进样口的压力,导致影响色谱峰拖尾,从而造成定量不准确,所以解析流速选用分别为25ul/s。[0046]7、解析气体体积的选择:实验条件是:实验条件是:SPNd1-WAX-5056的萃取针头,平衡温度90℃,萃取次数50次,萃取流速200ul/s,预解析时间30s,解析流速25ul/s,测定解析气体体积分别为500ul、750ul、1000ul、1500ul时各化合物的响应值,如表7:
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表7解析气体体积的优化
[0048]
从表中可以看出,解析气体体积为1000ul时,各化合物的响应值最大,所以选用解
析气体体积1000ul。[0050]8、预解析时间的选择:实验条件是:SPNd1-WAX-5056的萃取针头,平衡温度90℃,萃取次数50次,萃取流速200ul/s,解析气体体积为1000ul,解析流速25ul/s,测定预解析时间分别为0s、10s、15s、30s时各化合物的响应值,如表8:[0051]表8预解析时间的优化
[0049]
[0052]
从表中可以看出,预解析时间为30s时,各化合物的响应值最大,所以选用预解析
时间为30s。[0054]实施例2
[0055]精密称取粪便100mg于10ml顶空瓶中,加入纯水1ml,混匀后上机检测。[0056]本发明的技术方案采用安捷伦7890A气相色谱系统、色谱柱为安捷伦CP9205VF-WAX ms(30m×0.25mm×0.25μm)、7000QQQ-MS检测器、固相动态微萃取装置(CTC,Germany)、萃取头涂层为聚乙二醇(PEG)(内径50μm,长56mm)(CTC,Germany),进行萃取、色谱分离、质谱检测分析。
[0057]固相动态微萃取条件:SPNd1-WAX-5056萃取头、萃取次数50次、预热平衡时间为3分钟、预热平衡温度90℃、萃取针温度95℃、萃取流速200μl/s、解析气体体积为1ml。[0058]气相色谱分析条件:升温程序为:初始温度70℃,保持l min,按10℃/min升温速率升温至200℃,保持2min,30℃/min升温速率升温至240℃,保持2min,进样口温度为250℃。载气是高纯度氦气,恒压进样,压力为14.135psi流速为1.0mL/min,进样方式为不分流模式。[0059]质谱检测条件:扫描范围m/z:30～300,溶剂延迟时间7分钟,传输线、离子源温度分别是250,300℃。倍增器电压值为1853V。通过Mass Hunter工作站采集和处理数据(B.05.021032版本,Agilent Technologies,USA)进行数据分析。[0060]本发明技术方案使用的对照品乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、纯度均在
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99％以上。分取乙酸和丙酸50μl,异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸各20μl,置10mL容量瓶中加纯水定容,乙酸和丙酸溶液浓度为5ml/L,异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸溶液浓度为2ml/L,实验中按需要稀释现配。配制和检测乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、对照品溶液的目的在于,确认其各自色谱峰的保留时间和质谱的碎片离子信息,以便判断样品中所含有的短链脂肪酸的种类。
[0061]每个分析物的检出限为每个分析物相对于噪音信号3倍的浓度的峰面积。每个分析物的定量限为每个分析物相对于噪音信号10倍的浓度的峰面积。[0062]表9标准溶液中短链脂肪酸的保留时间、标准曲线、检测限、定量限和精密度
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粪便中短链脂肪酸的测定结果如下:
表10粪便中短链脂肪酸含量的测定结果
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实施例3
[0069]肠道内容物为小鼠的肠内容物,精密称取肠道内容物40mg于10ml顶空瓶中,加入纯水1ml,混匀后上机检测。检测条件与实施例1一致。[0070]表11肠道内容物中短链脂肪酸含量的测定结果
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说 明 书 附 图
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