DNA浓度和纯度的测定

DNA浓度和纯度的测定 一、原理

DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。

对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02

当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg / ml ssDNA浓度约为37μg / ml RNA浓度约为40μg / ml

寡核苷酸浓度约为30μg / ml（youyu底物不同有差异）当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。

经验值：

纯DNA：OD260 / OD280≈1.8 (＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）

纯RNA：1.7 ＜OD260 / OD280＜2.0 （＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）

若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用方案二的方法或其他方法进行估算。

二、材料、试剂及器具 1、材料

提取的PUC19样品、PUC19标准样品 2、试剂

灭菌重蒸水，TE缓冲液 3、器皿

石英比色皿；UV-240紫外分光光度计

二、实验步骤

1、UV-240紫外分光光度计开机预热10min.

2、用重蒸水洗涤石英比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。

3、设定狭缝后校零。

4、将标准样品和待测样品适当稀释（DNA 5μl或RNA 4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记录编号和稀释度。

5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。

6、设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。

7、计算待测样品的浓度与纯度。

DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/1000 RNA样品的浓度（μg / μl）：OD260×稀释倍数×40/1000 方案二溴化乙锭法 一、原理

溴化乙锭（EB）是一种嵌入型染料，其上的一个扁平的基团可插入到DNA 或RNA链的堆积碱基之间。溴化乙锭的嵌入基团与碱基的接近使二者紧密结合。DNA吸收254nm的紫外辐射并传递能量给EB，而EB本身在302nm和366nm 处有光吸收。吸收的能量在590nm处释放，并表现为橙红色荧光。结合的EB的荧光产率远大于游离EB的荧光产率。EB结合量的多少与DNA的大小和构型有关，而荧光强度正比于嵌入溴化乙锭的量。对于单一构型的同种DNA样品来说，溴化乙锭的嵌入量与样品溶液的DNA含量成正比。

二、材料、试剂及器具

1、标准DNA样品:已知浓度的线型DNA，以TE稀释为梯度浓度的一系列标准样

品。

2、质粒DNA的酶切样品（待测）

3、溴化乙锭（EB）5μg / ml：以PH8.0的TE稀释10mg/ml母

液而的。

4、紫外透射仪。 三、操作步骤

黑色塑料板（或其他替代物） ↓

在其上点上两排溴化乙锭2μl液滴，每排六点 ↓

取标准样品2μl与第一排溴化乙锭混匀，则各点的DNA浓度分别为

（单位：ng/μl）:20、15、10、5、2、1 ↓

取待测样品经过梯度稀释后，各加2μl于第二排的溴化乙锭上混匀 梯度稀释（单位：μl） ↓

把以上塑料板放到紫外投射仪的样品台上 ↓

关好样品室门。以短波紫外光激发荧光。观察每一点的荧光强度或拍照。

比较上下两排得亮度，确定待测样品的浓度 四、注意事项

1、标准样品含单一种类的DNA，且大小与待测样品相近。 2、待测样品和标准样品使用同样的体积.

3、EB具有中度毒性、强致癌性，操作时切记戴手套，切勿沾染到衣物、皮肤、

眼晴、口鼻等。

4、沾有EB的用具使用完毕统一集中于回收容器中，经净化处理后方可弃。

五、实验报告

1、绘出所观察到的现象（以点的密度代表亮度） 2、请估算待测DNA原液的浓度。

要求记录测定原始数据，计算待测样品的浓度和纯度；并对你的实验结果作出评价，提出下一步提纯工作的设想。

琼脂糖凝胶电泳检测DNA

采用1%的琼脂糖进行电泳，实验步骤为:

a. 制胶：称取0.2g琼脂糖转入三角瓶中，加入20mL 1×TAE，混匀，于微波炉中加热融化。稍冷却后，加入1μL EB溶液（10mg/mL），倒入预先插入梳子的凝胶槽（12cm×12cm）内。待胶凝固后，竖直拔出梳子；

b. 上样：在水平电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，将凝胶槽转移到电泳槽（HE-120，上海天能科技有限公司）中，保证缓冲液的液面高于凝胶表面。在封口膜上将5μL DNA样品和1μL 6×loading buffer混合均匀，然后小心的加入到凝胶的点样孔中。Marker为λ DNA/Hind III，上样量为5μL。

c. 跑胶：确认样品孔所在的一侧为阴极，打开电泳仪（EPS-300，上海天能），设定电压为85V进行跑胶。

d. 凝胶成像：待溴酚蓝迁移到终端时停止电泳。在凝胶成像系统（Bio-rad GelDoc XR，美国伯乐公司）的紫外光下观察并拍照。