洋桔梗ACC合酶基因RNA干扰之载体pCAMBIA1301-gfp-(GUS+ACS)i-NPTII的构建第一篇周记

（1）取洋桔梗无菌苗幼嫩叶片100mg，加入液氮充分研成粉末；

（2）将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700ul65℃预热缓冲液GP1的离心管中，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min,水浴过程中颠倒离心管数次，混匀样品； （3）加入700ul氯仿，充分混匀，12,000rpm(～13,400×g)离心5min;

(4).小心将上一步得到的上层水相转移到另一新的离心管中，加入700ul缓冲液GP2，充分混匀；

（5）将混匀的液体转移到吸附柱CB3中，12,000rpm(～13,400×g)离心30s,弃掉废液； （6）向吸附柱CB3中加入500ul的去蛋白液GD，12,000rpm(～13,400×g)离心30s,弃掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

（7）向吸附柱CB3中加入700ul的漂洗也PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30s,弃掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(8) 向吸附柱CB3中加入500ul的漂洗也PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30s,弃掉废液； （9）将吸附柱CB3放入收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，去除吸附柱中残留的漂洗液。将吸附柱CB3置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液；

（10）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50-200ul经65～70℃水浴预热的洗脱液TE，室温放置2～5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中；

(11)离心得到的液体再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min。

（12）将所提取的模板DNA稀释后，用紫外分光光度计测定其OD260／OD280的比值，估计样品的纯度，并结合浓度0.8﹪琼脂糖凝胶电泳结果，确定其含量和完整性； （13）将所得溶液稀释至20ng／ul备用。